Explicația profesorului

Metodologia studiilor și orientările referitoare la acest subiect.

Subiect 16. Titrarea virusurilor

Sarcina la următoarea lecție.

Rezumând sesiunii.

Pentru a determina prezența anticorpilor în serul sanguin de iepure la virusul bolii Newcastle.

Munca independentă: a) în Golful slide-uri de agar; b) producerea găuri într-un strat de agar; c) componente deversare RDP; d) camera de viteze umed; d) schema Sketch DSA în caiete; e) înregistrări ale rezultatelor PDR și PDR care intră în schema în următoarea zi sau lecția următoare.

1. Care este principiul PDR?

2. Ce probleme pot rezolva PDR?

3. Care sunt avantajele și dezavantajele PDR?

Scopul claselor: introducerea metodei de titrare a virusurilor

Echipamente și materiale: sarcina de a determina titrul virusului în ED50 pe baza datelor reale, trase pe carduri (pentru fiecare carte de student unul, toate cu cel puțin 10 variante de sarcini); fluid alantoidian de embrioni de pui infectate cu boala de Newcastle; suspensie 1% din celulele roșii din sânge de pui spălate; ser fiziologic (soluție izotonică de NaCI); gaura panou Plexiglas; pipetă gradată de 1 ml; pere de cauciuc; umplut cu soluție de dezinfectare; creioane pentru scris pe sticlă, calculatoare, tabele logaritmică, echipamente multimedia, prezentări, MS Office Power Point pe tema ocupării forței de muncă.

Lucrarea de laborator cu producția și practica veterinară viruși biofabrichnom de multe ori au nevoie pentru a determina cantitatea de virus într-un anumit material. Fără o astfel de definiție este imposibilă experimental infectat cu viruși sisteme de laborator, producția de vaccinuri virale vii și inactivate și produse de diagnostic, evaluarea activității vaccinurilor cu virusuri vii vii, obtinerea seruri imune și multe alte lucrări.

Cantitatea de virus din orice material este determinat prin titrul virusului în acest material. Sub titrul virusului înțeleg expresia de concentrare a materialului.

Titrul virusului - aceasta este cantitatea de virus conținută în unitatea de volumul materialului. Deoarece cantitatea de virus nu poate fi exprimată în mod obișnuit utilizat (volum, greutate și așa mai departe. N.) Unitățile resort la măsurarea în unități de unități de acțiune sau activitate. Și virusuri infecțioase au activitate hemaglutinantă. Prin urmare, unitatea de cantitatea de infecții virale și hemaglutinant.

Dimensiunea acestor unități zivisit completă și raportul dintre virionii defecte în metoda de titrare obiect suspensie utilizată și de alți factori. În practică, acesta a fost folosit trei tipuri de numărul de unități de virus: 1 - unități infecțioase de leziuni locale cauzate de virusuri și evaluate într-un singur efect; A 2 - unități infecțioase de 50% din virusurile din sensibile obiectele vii evaluate statistic; 3a - hemaglutinante unități.

De la o deteriorare locală cauzată de viruși, cele mai cunoscute placi din culturi de celule infectate (insulele intr-un strat de celule moarte vii) si pockmarks (noduli necrotice) pe embrionii de pui hao infectate si alte virusuri pox. În cazul unor astfel de manifestări ale activității infecțioase a cantității de virus al virusului poate fi măsurată în unități formatoare de plăci formatoare (pfu) sau unități ospoobrazuyuschih (ooe). Un UFP este o doză de un virus care poate provoca formarea unei placi si unul ooe - unul pockmarks.

Metoda cea mai versatilă de determinare a titrului virusului în unități de acțiune infectantă 50%. Conform acestei metode, per unitate de cantitate de virus este adoptat o astfel de doză care este capabilă să provoace efectul infecțios în 50% din obiectele de test inoculate. Acesta este desemnat ca DE50 - doză efectivă de 50%. Numărul de doze de virus per unitate de volum a materialului, și va exprima titrul viral în materialul.

Tipuri de unități de viruși determinat printr-o acțiune infecție 50%

Tipuri de virusuri infecție

Deoarece obiectele de testare în laboratoarele de obicei folosesc șoareci albi, embrioni de pui și culturi de celule în care acțiunea virusului infecțios poate manifesta moartea, simptomele clinice și modificări de efect citopatic pathoanatomical. Pentru fiecare sensibilitate virus selectat la obiectul supus încercării și acțiunii sale formă de înregistrare infecțioasă, prin care se evaluează efectul infecției. În funcție de tipul de test obiect și forme de acțiune infectantă ED50 ia una dintre următoarele tipuri prezentate în tabelul 6.

1 este o doză DL50 de virus care ucide 50% dintre animalele de laborator (șoareci tipic alb);

ID50 -Dose 1 virus care cauzează simptome clinice sau modificări patologice în 50% dintre animalele de laborator infectate;

ELD 1 - o doză de virus care ucide 50% dintre embrioni de pui;

1 -Dose EID50 virus provoacă modificări patologice în 50% din embrioni de pui infectate;

TSPD50 1 - o doza de virus care produce efect citopatic în 50% din culturi de celule infectate (în mod tipic tuburi cu culturi de celule).

Numărul ED50 (DL50. ID ELD50. EID50 sau TSPD50) virus conținute într-o unitate de volum material conținând virus, și va fi titrul de expresie (T) a virusului în acest material. De exemplu, T = 10 3.48 TSPD50 / 0,1 ml înseamnă că fiecare 0,1 ml dintr-un material care conține virusul este conținut 10 3 '48 doze de virus (m. E. Peste 1000, dar mai mică de 10.000, și anume 10 3 48 = 3020), din care fiecare este capabil să inducă un efect citopatic în 50% din eprubete cu cultura de celule.

Respectivele unități 50% din infecția cu virus (DL50. DI50. ELD50. EID50. TSPD50) sunt utilizate în cazurile de evaluare infecțioase a virusului cu statistic evaluate efectul are loc, atunci când păstrarea infecție a virusului se realizează prin efectul letal, simptome clinice, modificări patologice sau efect citopatic.

Titrarea virusului printr-o acțiune infecție 50% - tehnica cea mai versatil este potrivit pentru aproape orice titrare a virusului, dacă vă ridicați sensibile la acesta în direct de sistem (obiect text). Cu toate acestea, această metodă de titrare a virusului este destul de consumatoare de timp și necesită un calcule statistice lungi.

Problema determinării titrul virusului în unități de acțiune infecțioase 50% (DL50. DI50. ELD50. EID50. TSPD50) se reduce la este de a găsi o diluare a materialului care conține virusul testat în cantitate de doză infecțioasă care ar conține un ED50. și apoi se calculează câte unități de virus conținute în același volum de material conținând virus, care este un indicator al titrului virusului în acest material.

Pentru a rezolva această problemă, în primul material care conține virusul cercetat a fost preparat printr-o serie de diluții de 10 ori succesive. diluții de 10 ori de încărcare, din două motive:

În primul rând, așa cum se vede din grafic al efectului o doze infecțioase de virus (Fig. 35), curba dependenței aproape de punctul corespunzător ED50. la un interval considerabil se apropie de o linie dreaptă.

Figura 35. Un grafic al efectului dozei infecțioase de virus

Acest lucru înseamnă că, în anumite limite, al cărei centru se află la DE50. între logaritmul dozei (diluție) a virusului și efectul infecțios există o relație rectiliniu, adică, cantitatea de efect infecțios este proporțională cu logaritmul dozei de virus (sau o diluție) în doze mici și deosebit de ridicate ale acestei dependențe este rupt ..;

în al doilea rând, la 10 ori mai mare de diluare facilitează calculele ulterioare.

volume egale a câte diluții de 10 ori testului inoculat cu materiale grupe egale conținând virusuri susceptibile la acest virus viu obiecte de test (șoareci, embrioni de pui sau culturi de celule). Astfel, în fiecare grup ar trebui să fie de cel puțin 4-6 obiecte de testare, deoarece mai puține calculate statistic titrului virusului valoare va avea prea mult de eroare (valoare statistică mai exactă decât o cantitate mai mare de date inițiale se bazează).

După infectare, contul virus pentru rezultatul acțiunii (deces, simptome clinice, modificări patologice sau CPE) în obiectele infectate și care determină diluarea în virusul sa dovedit a fi eficace cu 50% a obiectelor sensibile. Diluția dând 50% efect este calculat prin interpolare rectilinie. Când o astfel de diluare găsit, se consideră că un volum de infectare cu virusul, diluat găsit (corespunzând unei 50% efect) de mai multe ori, conține 1 ED50. În aceeași sursă de ecran (nediluat) conținând virusuri materiale astfel de doze (ED50) conține mai multe ori de câte ori lucrurile a fost diluat, 1 a dat ED50. Apoi convertit, cum ar fi unități de 50% infectare a virusului este conținut în volum (ml) unitate material conținând virus, care va fi o expresie a titrului virusului în materialul.