Diagnosticul de infecție coronavirus prin reacția în lanț a polimerazei (PCR)

infectie coronavirus de pisici și câini sunt cauzate de membri ai genului coronavirus (familia Coronaviridae). Manifestarea principală a infecției cu coronavirus la câini este diareea. V coronavirusuri provoca enterită și pisica peritonita infecțioasă, larg răspândită în rândul pisicilor domestice și sălbatice.

Agentul cauzal al infecției coronavirus la câini este coronavirusul canin, coronavirusul provoaca enterita acuta. Boala se transmite prin contactul direct cu purtătorul virusului (prin salivă și fecale). Această infecție câinii susceptibile de toate vârstele, dar cel mai frecvent afecteaza pui si animale slabe, care au avut deja o altă boală, cum ar fi infectia cu parvovirus.

Principalele simptome ale bolii - vărsături și diaree, uneori amestecate cu sânge, deshidratare, pierdere în greutate, letargie. 3-4 săptămâni după recuperare, se poate dezvolta boala recurente. Atunci când se efectuează diagnosticarea câini enterită coronavirusiri trebuie diferentiata de enterită cu parvovirus, infecția adenovirală de tip intestinal și bolii Carré.

Coronavirusuri, care afectează pisicile, sunt reprezentate de două biotipuri: FECV sau pisici enterită coronavirusiri si FIPV - virusul peritonitei infecțioase a pisicilor (2, 3). Purtătorii FECV este 16-50% dintre pisicile domestice, în care virusul este localizat în intestinul subțire, fără a provoca boli sau pot deveni o diaree cauza usoara. În același moment 5-12% dintre purtători pot fi observate mutatie patogene forme patogene intestinale în FECV (FIPV), ceea ce duce la dezvoltarea bolii (2).

peritonitei infecțioase (SP, FIP) pisicile se termină de obicei este letală, are loc in doua forme - umede și uscate. Umedă (exudativă) Forma SP este caracterizata prin leziuni ale vaselor sanguine ale cavitatilor abdominale sau toracice, însoțite de exsudație plasmă în respectiva cavitate (Fig. 1). Pacientii animalele au dezvoltat ascită (Figura 2), iar în cazul retentiei de lichide - o încălcare a funcției respiratorii. In tegument seros cavitatea abdominală formate depuneri fibrinoase (Fig. 3), denumit în continuare pot forma adeziunilor. Din cauza anomalii ale funcției hepatice observate sclera ekterichnost și piele.

Dry (nonexudative) Forma IP are loc fără acumulare de lichid în cavitățile abdominale și toracice. În acest caz, organele interne afectate -. Creier (Figura 4.), ficat, rinichi, pancreas, 25% din daune observate la ochi (Figura 5) (5).

Deoarece schema de tratament eficace SP nu a fost încă dezvoltat, sunt măsuri profilactice primordiale care vizează depistarea precoce a infecției cu virusul (1, 3).

Diagnosticul unei peritonitei infecțioase de pisici este, de asemenea, o problemă gravă. Metodele tradiționale de detectare a agentului patogen bazat pe detectarea anticorpilor la coronavirus (IHA ELISA), furnizează până la 60% din rezultate pozitive false. Acest lucru se datorează prezenței în intestin pisicilor tulpini patogene oportuniste (2, 3). Numărul de laboratoare străine utilizate metode complexe de diagnostic, SP, inclusiv definiția:
- anticorpi titrului la coronavirus;
- raportul dintre albumină / globulină transudat sau plasmă;
- un glicopril teină nivel 1 acid (AGP);
- citologice și parametrii hematologici (4).

Materiale și metode
Studiul coronavirus tulpina "Bagheera" a fost folosit (1og 5 TCD 50 / ml) la diluții, 8 izolate de pisici coronavirusiri (FcoV), 2 tulpini de coronavirus de câini (CCV) și calicivirusul suspensie de virus și pisici panleucopeniei feline.
În cazul în care testul PCR a sistemului de testare utilizat material biologic al pisicilor sănătoase, animalele cu semne clinice de SP și pisici cu simptome nespecifice. Printre animalele testate au fost ambele conținute în pepiniere și sunt la conținuturile individuale.
Materialul biologic a fost investigat în paralel prin PCR și RIGA. Sistemele PCR au fost investigate folosind fecale, plasma de sânge, transudat ascită la RIGA specifice și metoda - sânge și transudat ser.

Testele serologice au fost efectuate cu ajutorul unui kit pentru detectarea anticorpilor la coronavirusiri carnivoră din RIGA (TU 9388-025-00494189-01). câini material biologic a fost investigată prin metoda PCR.

Cu toate acestea, acest studiu necesită o investiție semnificativă de timp și bani. În acest sens, o metodă eficientă de diagnostic SP poate servi ca o reacție în lanț a polimerazei (PCR), care permite nu numai pentru a detecta pisici coronavirusuri, dar diferențierea tulpinilor patogene și condiționat patogene bazate pe localizarea lor diferit în organism. Astfel, detectarea virusului in fecale de pisici indică purtători de tulpini oportuniste (FECV) și plasma de sânge sau fluid de ascită, - care circula in organism a tulpinilor patogene de animale (FIPV) și ca urmare a bolii.

Scopul acestui studiu - un test al sistemului de testare pentru diagnosticul infecției cu coronavirus la câini și pisici bazate pe PCR.

Izolarea ARN a fost realizată folosind un set de „ARN-Sorb“ (CRIE), pe baza metodei de sorbție sale pe silicagel. PCR a fost realizată pe un TERTSIK termocicluri ( „tehnologia ADN-ului“) ca procedură standard. Produsele de PCR rezultate au fost vizualizate prin electroforeză în gel de agaroză 1,5% conținând bromură de etidiu.

Au fost selectate primeri specifici țintă pentru secvențele conservate de două gene de proteină nucleocapsidă. Specificitatea primerilor propuse studiate folosind programe de calculator FASTA și BLASTA. Ca rezultat al acestei lucrări a fost dezvăluit omologie de oligonucleotide selectate doar cu gene FcoV si CCV proteina nucleocapsidei și a găsit omologie semnificativă a acestora cu secvențele de nucleotide ale altor specii ale Coronaviridele familiei, precum și orice alte virusuri, bacterii și eucariote. Astfel, primerii propuși pe baza calculelor teoretice, trebuie să aibă% specificitate 100.

In urmatoarea faza a studiului au fost optimizate condițiile pentru izolarea ARN-ului viral și transcriere și PCR, precum și specificitate determinată și sensibilitatea analizei PCR inversă. PCR dimensiunea produsului a fost de 350 bp. Metoda a aratat 100% specificitate și sensibilitate ridicată. Detectarea coronavirusului în fecale de pisici ce indică transportul său de tulpini oportuniste in intestin, FECV detectarea unui transudat de plasmă și sânge - pe dezvoltarea bolii.

In studiul de IHA a fost considerat pozitiv de detectare a unui titru de anticorpi animal> 1: 128. Cu toate acestea, acest lucru ar putea indica fie de virus, iar forma vădită a infecției. Mai mult decât atât, un titru pozitiv se poate datora prezenței contactului cu coronavirus anterior. Ca material de fecale câini investigați și detectând le coronavirusului ARN indicativ al bolii cauzate de CCV.

Materialul biologic colectat de la 193 pisici (Tabelul I) a fost investigat în timpul experimentului. Metoda RNGA rezultat pozitiv a fost înregistrat la 131 de animale (titruri> 1: 128). Când testarea „ARN“ pisici seropozitive coronavirusul prin PCR a fost detectat în fluidul plasmatic și ascitic de 12 animale (9%) numai în fecale - 68 (52%) și 51 (39%) - nu a fost detectată deloc. Astfel, 52% dintre pisici au rezultat seropozitiv susține tulpini coronavirusiri condiționat patogene, iar 39% au fost sănătoși. Evident, studiul de IHA a dat 63% rezultate lozhnopolozhitelngh (pe baza numărului total de animale testate).

concluzie
Rezultatele sugereaza ca diagnosticul de infectie coronavirus a pisicilor metode serologice convenționale (IHA) oferă mai mult de 60% rezultate fals pozitive, deoarece nu permite să se diferențieze o stare adevărată purtătoare a bolii. În plus, „seropozitiv“ au fost considerate animale care au avut contact cu coronavirus anterior.

Utilizarea PCR a permis o diferențiere a tulpinilor patogene și condiționat patogene datorită lor localizare timp personal în organism, precum și pentru a distinge starea de purtător din cauza acestei boli. Astfel, datele studiului sugerează posibilitatea utilizării metodei PCR pentru a detecta pisicile și câinii coronavirusiri, și diagnosticul final.

EA Yaralova, IL Obuhov, MM Rahmaninov, EI Elizbarashvili, V.I.ULASOV,
Vserumynsky Centrul de Stat pentru Calitate si Standardizare de droguri de animale și a furajelor, București