proteine ​​recombinante

Rezumatul biotehnologiei

„Proteinele recombinante (proprietăți de preparare a plasmidelor)“

Ingineria genetică a caracterizare specifică și precisă a obiectelor de celule, și operează în principal, cu diferite forme și dimensiuni de fragmente celulare. THERMO "inginerie genetică", "inginerie genetică" și "ADN-ului recombinant" - echivalent [3].

Ingineria genetică poate fi reprezentat ca un compus al fragmentelor de ADN de origine naturală și sintetică sau o combinație de teste in vitro urmată de introducerea structurilor recombinante obținute în celula vie, astfel încât fragmentul ADN inserat după includerea sa într-un cromozom sau replicat sau exprimat în mod autonom.

În principal în producția de proteine ​​recombinante este de a rezolva problema lipsei de materii prime, ca de tesut uman pe o scară comercială, este imposibil de a le obține.

Ca producerea de proteine ​​recombinante umane cel mai frecvent utilizate în prezent: E. coli (Escherichia coli), Bacillus subtilis (Hay bacillus), Saccharomyces cerevisiae (drojdie).

Aceste organisme sunt destul de sigur, dar obținerea în mediu nu este de dorit din mai multe motive. În acest sens, se adoptă și urmați cu atenție regulile de lucru cu recombinanții.

Securitatea trebuie să fie respectate la nivel genetic și fizic și se referă la producerea de oricare dintre proteinele recombinante.

1. Metode de inginerie genetică în prepararea proteinelor recombinante

Ingineria genetica - Design functional activ in structurile genetice in vitro (ADN recombinant), sau altfel - crearea de programe genetice artificiale (Baev AA). Prin ES inginerie genetică Piruzyan - tehnici de sistem experimental, permițând laborator de proiectare (in vitro), structuri artificiale genetice in forma de molecule de ADN recombinant așa-numita hibrid sau.

Ingineria genetică - obținerea de noi combinații de material genetic se realizează prin manipularea celulelor cu molecule de acid nucleic și structuri create de transfer de gene din organism viu, în care se realizează prin încorporarea și activitatea în acest organism și descendenții săi. Este vorba de direcția într-un design program predeterminat de sisteme moleculare genetice in afara corpului, urmată de introducerea unui corp viu. ADN-ul recombinant care devine parte integrantă a aparatului genetic retsepientnogo corpului si a raportat de proprietăți noi și unice genetice, biochimice și apoi fiziologice.

Aplicarea Scopul ingineriei genetice este de a construi astfel de molecule de ADN recombinant, care atunci când sunt încorporate în aparatul genetic atașat la proprietățile corpului utile omului. De exemplu, prepararea „reactoarelor biologice“ - microorganisme, plante și animale care produc substanțe farmacologic importante pentru om, creând soiuri de plante și specii de animale cu anumite caracteristici valoroase pentru umane. metode de inginerie genetică permit certificarea genetică, pentru a diagnostica boli genetice, pentru a crea un vaccin ADN pentru a efectua terapia genică a diferitelor boli [1].

Tehnologia ADN-ului recombinant utilizează următoarele metode:

- clivaj specific al ADN-ului cu nucleaze de restricție accelerând selecție și manipulare a genelor individuale;

- secvențiere rapidă a nucleotidelor purificate fragment de ADN care permite definirea limitelor genei și secvența de aminoacizi codificată de aceasta;

- construirea unui ADN recombinant;

- hibridizarea acidului nucleic, care permite detectarea secvențelor specifice de ADN sau ARN cu o mai mare precizie și sensibilitate pe baza capacității lor de a se lega la secvențele de acid nucleic complementare;

- DNA Cloning: in amplificarea in vitro utilizând reacția de polimerizare în lanț sau introducerea unui fragment de ADN în celula bacteriană, care după transformarea produce un fragment în milioane de exemplare;

- introducerea ADN-ului recombinant în celule sau organisme.

Construcția de molecule recombinante prin intermediul unui număr de enzime - în special enzime de restricție. Acesta este utilizat în prezent mai mult de 400 de enzime de restricție diferite. Aceste enzime sunt sintetizate varietate de microorganisme [5].

Enzimele de restricție să recunoască și să cliveze secvențe de nucleotide specifice în molecula de ADN dublu catenar. Cu toate acestea, unele enzime de restricție cu clonarea moleculară insuficientă, deoarece legăturile de hidrogen dintre cele patru baze care formează capete coezive, nu atât de puternice pentru a ține unite două fragmente de ADN.

Unul dintre molecula de ADN recombinant poarta gena, care este de așteptat să fie clonat, cealaltă - conține informațiile necesare pentru replicare în celula ADN-ului recombinant.

2. Plasmidele. Conceptul și tipuri de plasmide

Cea mai comună metodă este metoda de recombinare inginerie genetică (care conține o genă străină) plasmide, care sunt circulare molecula de ADN dublu catenar constând dintr-o multitudine de perechi de nucleotide și capabil de replicare autonomă [4].

Pentru plasmide caracterizate prin existența stabilă în stare non-cromozomiale la bacterii. Fiecare bacterie, în plus față de principal, nu părăsește celula de molecule de ADN (5 x 106 perechi de baze) pot conține mai multe plasmide diferite, care comunică cu alte bacterii.

Plasmidele variind în mărime de la câteva mii până la sute de mii de perechi de baze, precum și numărul de copii per celulă - de la una la câteva sute, sunt capabile de replicare autonom (independent de cromozomul principal) și este moștenită stabil într-un număr de generații de celule.

Deși multe da celule gazdă plasmidic avantaje selective tangibile (rezistență la antibiotice, metale grele, etc.), cele mai multe dintre ele sunt criptice, adică nu se manifestă în fenotipul celulei.

Originea replicării ColE1 plasmid mici care transportă genele de rezistență la colicinei utilizate în mod convențional în ingineria genetică în construcția de molecule ADN vector care sunt utilizate pentru donarea și exprimarea în celule de E. coli, secvențe de nucleotide scurte.

Plasmidele găsite în multe bacterii care aparțin diferitelor grupuri taxonomice. Cantitatea de ADN plasmidic în celulă este, de obicei, nu mai mult de un procent din genomul celular puține, iar numărul plasmide variază de la 1 la 38. Plasmidele - o moleculă de ADN circular închis covalent liniar sau conținând de la 1.500 la 40.000 perechi de baze. Cele mai multe plasmide constau din trei grupuri de gene: regiunea ADN responsabilă pentru replicarea autonomă a plasmidei în celulă; sistem de gene care permit plasmidele de transfer de la o celulă la alta; gene care determină proprietățile care sunt utile pentru celulele gazdă. O trăsătură distinctivă a plasmidelor - capacitatea de replicare autonomă, prin urmare, cantitatea minimă de ADN care poate fi numită o plasmidă - este un fragment care asigură replicarea autonomă a ADN-ului plasmidic în celulă ca întreg.

De obicei, prezența plasmidelor în celula bacteriană este evaluată prin apariția unor simptome, care includ rezistența la anumite medicamente, capacitatea de a transfera gene in timpul conjugare, sinteza substanțelor antibiotice ale naturii, capacitatea de a utiliza o anumită degradare zahăr sau pentru a furniza un număr de substanțe.

Cele mai multe plasmide bacteriene are capacitatea de a se replica autonom are factorul de incompatibilitate și factor de transfer. Plasmidele transporta o pluralitate de, determinate fiecare plasmidă markeri specifici: rezistența la antibiotice, materiale feroase grele, radiații ultraviolete, capacitatea de biosinteza toxinelor.

Deoarece vectorii pot fi utilizate opuholeobrazuyuschie plasmidă bacteriană. tipuri de bacterii Agrobacterium nodulilor legate de evolutionar care aparțin genului Rhizobium, și au multe caracteristici în comun cu ei. Cu toate acestea, natura interacțiunii cu Agrobacterium planta are caracteristici specifice [6].

Interacțiunea specie Agrobacterium la plante este de interes deosebit, deoarece atunci când acest tip de parasitism un partener specific modifică proprietățile gazdei prin inserarea genelor lor în genomul său. În plus, ea servește ca un exemplu unic de migrare ADN procariot în celula eucariotă. Mitocondriile și cloroplastele conțin sistemul genetic complet, adică toate componentele necesare pentru exprimarea informației genetice: ADN, ADN polimerază, ARN polimerază și mașinile-sintetizarea proteinelor (ribozomi, ARNt, aminoacil-ARNt sintetaza).

3. Prepararea plasmidelor

Cea mai comună metodă este metoda de recombinare inginerie genetică apoi estsoderzhaschih plasmide de gene străine.

Fiecare bacterie, în plus față de principal, nu părăsește celula de molecule de ADN (aproximativ 5-6 milioane. Perechile de baze), poate conține mai multe plasmide diferite, care comunică cu alte bacterii.

Plasmidele sunt elemente genetice autonome (adică replicare, înmulțirea) în celula bacteriană nu este în același timp în care molecula de ADN principal. Deși plasmide reprezintă doar o mică parte din ADN-ul celulei, ele sunt astfel vitale pentru gene bacterii, gene de rezistență. Diferite plasmide conțin gene diferite de rezistență la antibiotice.

vectorii plasmidici care au tendința de a crea prin inginerie genetica, astfel ca naturale (nemodificat) plasmid serie Devalizarea „vector vysokokachestvennnogo“ proprietăți de legare:

- dimensiuni mici, deoarece eficiența transferului de ADN exogen în plasmida descrește cu lungimea E.coli peste 15 kilobaze;

- prezența situsului de restricție, care a efectuat inserția;

- prezența unuia sau a mai selectiv mrkerov genetice pentru identificarea celulelor primitoare care poartă ADN-ul recombinant.

Pentru ADN-ul plasmidic recombinant dintr-o plasmidă este scindat cu enzima de restricție aleasă. Gena, care este necesară pentru a intra in celula bacteriana, este scindată din ADN-ul de cromozomi umani cu o enzimă de restricție, deci este „lipicios“ capete sunt secvențe de nucleotide complementare la capetele plasmidei.

Ligase enzima „lipici“ cele două bucăți de ADN care rezultă într-un inel de plasmidă recombinantă, care este introdus în bacteria E. coli. Toți descendenții de bacterii (clone) conțin plasmide de gene străine. Acest întreg proces se numește clonare.

Introdus plasmidei în celule somatice prin agenți chimici care măresc permeabilitatea membranei celulare. În special, pentru a asigura penetrarea ADN-ului plasmidic celule, ele sunt tratate cu o soluție de clorură de calciu rece ca gheața, și apoi se incubează la 42 ° C timp de 1,5 minute. Acest tratament duce la o distrugere locală a peretelui celular. Valoarea maximă a -10-3 frecvență de transformare, adică pentru fiecare o mie de celule, există o transformată. Transformarea de frecvență nu este de 100%, atunci utilizați schemele de selecție care permit identificarea celulelor transformate [2].

Ca o plasmidă marker de poate cuprinde genele care determină rezistență la bacterii la antibiotice. Inserția genei străine (donor) marker de genă care rezultă în inactivarea acesteia. Acest lucru permite de a distinge celulele transformate care au primit plasmida vector (a pierdut rezistența la antibiotice), din celule care au primit molecula recombinantă (rezistența reținută la una, dar au pierdut rezistența la un alt antibiotic). Această tehnică se numește inactivarea marker inserție.

Pentru selectarea celulelor transformate, conținând un ADN recombinant (hibridplasmidă) testează pentru rezistența la anumite antibiotice. De exemplu, celulele care adăpostesc o plasmidă hibridă, sunt rezistente la ampicilină, dar sensibile la tetraciclină (în care gena marker și ADN-ul donator introdus).

Procesul de separare a celulelor ADN genomic clonate și introducerea acestor elemente în celule gazdă se numește crearea unei biblioteci genomice (Clona Bank, banca de gene).

Tot sistemul de donare trebuie să îndeplinească două cerințe de bază:

prezența mai multor situri pentru donare;

posibilitate de identificare suficient de ușor de celule de ADN recombinant.

Pentru toate procedurile de rutină ale clonarii moleculare este utilizat pe scară largă în E.coli ca și celulele gazdă. Celulele capabile să absoarbă ADN străin sunt numite competente; competență crește E. coli, folosind condiții de cultură speciale. Pentru a obține cantități mari de proteine ​​străine de către tulpini recombinante ale plasmid E.coli a fost construită, care conține un promotor puternic, gena marker selectabilă și o scurtă secțiune cu multiple situsuri unice pentru enzime de restricție - polilenker.

Metode eficiente de transformare este electroporarea E. coli cu plasmidele (efect asupra membranelor celulare curentului electric pentru a crește permeabilitatea lor). Pentru introducerea genelor donate în celule somatice este de asemenea utilizat sau mikroukalyvaniya microinjectare și fuziunea celulară cu vezicule membranare încărcate cu ADN (lipozomi).

Fără exagerare, putem spune că trecutul, prezentul și viitorul biotehnologiei bazate pe interspecifice și a diversității genetice intraspecifice a organismelor. Modificări în nivelul de dezvoltare a științei contribuie doar la extinderea și apariția unei calitativ noi modalități de a utiliza această diversitate.

Astfel, dezvoltarea intensivă a cercetării fundamentale în biologie în a doua jumătate a secolului XX a condus la progrese substanțiale în aceste ramuri ale biologiei, biologie moleculara si genetica, biochimie si enzimologie, neurofiziologie și biofizică. Folosind metodologia științelor exacte (fizică, chimie, matematică) a permis cercetătorilor să caracterizeze diferitele procese vitale la nivelul interacțiunilor intermoleculare. Explicarea structurii ADN-ului și ARN-ului, procesul informației genetice a dus la dezvoltarea așa-numita ADN-tehnologie care a oferit oportunitatea de a lucra cu gene individuale cercetător - la anumite secțiuni ale materialului genetic.

Rezultatul este un instrument foarte eficient de studiu experimental al materialului genetic: organizarea, funcționarea și interacțiunea diferitelor elemente și evoluție. Pentru unele dintre cele mai studiate sunt genetic capabili de a obține, la figurat vorbind, „desene“ ale genomului.

Cand tehnica izolarea genelor individuale alese condiții pentru a păstra stabilitatea lor și tiparele definite ale transferului de gene, există o posibilitate reală de a construi un ADN recombinant (creare ADN recombinant literalmente înseamnă unirea (recombinarea) a două segmente de ADN de diferite tipuri) au fost dezvoltate. În esență, variația genetică a fost generată în mod deliberat de voință umană, și dacă se dorește, și organismele care au fost produse o astfel de combinație de gene (și, în consecință, atribute), care sunt absente în natură.

În prezent, mulți experți de inginerie genetică - tehnici de recombinare a ADN - sunt piatra de temelie a clădirii a biotehnologiei.

Folosind tehnici de inginerie genetică implică regia printr-un design program predeterminat de sisteme moleculare genetice in afara corpului, urmată de administrarea corpului viu.

Folosind metodologia de aspect ingineriei genetice aplicate implică construirea de molecule de ADN recombinant, care atunci când sunt încorporate în aparatul genetic atașat la proprietățile corpului utile omului.

Datorită acestei rezolva multe probleme practice: obtinerea „reactor biologic“ - microorganisme, plante și animale care produc farmacologic semnificative pentru preparatele proteice umane, crearea de rase foarte productive de animale cu anumite valori pentru trasaturi umane, eliminarea plantelor rezistente la diferiți agenți patogeni și dăunători și așa pe. Cu aceeași înaltă tehnologie și tehnologii genetice certificare legate si diagnosticul bolilor genetice și stabilirea de vaccinuri ADN și terapia diferitelor boli. Astfel, situația actuală favorabilă în biologie a fost un impuls puternic pentru dezvoltarea biotehnologiei moderne, o zonă foarte importantă a aplicării în practică a rezultatelor științelor de bază.

Glebov DC Transformarea genetică a celulelor somatice // Metode de cultivare de celule. L. Stiinta 1988.

Egorov NS Samuels VD Metodele actuale de creare a tulpinilor de microorganisme industriale // Biotechnology. Voi. 2. Școala Superioară M., 1988. 208 p.

Piruzyan ES Andrianov VM Plasmidul de Agrobacterium și inginerie genetică a plantelor. Nauka, Moscova, 1985. 280 pp.

Știri asociate: