job 9

Prin gemproteidam includ hemoglobina, mioglobina, citocromii și enzime - catalază și peroxidază. Ele constau dintr-o porțiune a proteinei și gruparea hem a subunității, care este un compus tetrapirolic legat la atomul de fier (II).

Acțiunea hemoglobinei acid acetic concentrat în prezență de NaCI hem intră hemin, în care fierul trivalent și a treia valență este asociată cu clor. Sub acțiunea alcaliilor asupra hemului hemoglobinei intră hematină, în care atomul de fier este, de asemenea, trivalent, iar a treia valență legată de o grupare hidroxil.

Hem aparține reacției de oxidare a hemoglobinei este mai rapidă a substraturilor (S · H2) peroxid de hidrogen, adică acționează ca o enzimă peroxidaza: S · H2 + H2 O2 - S + 2H2 O. Aceasta se datorează similaritatea structurii grupului protetice de hemoglobină și peroxidazei. Cu toate acestea, spre deosebire de enzima își păstrează proprietățile catalitice ale hemoglobinei prin fierbere și acțiunea acizilor puternici, care provoacă denaturarea proteinei.

Dacă materialul de testare conținut de sânge, prezența acestuia poate fi detectată prin capacitatea de a cataliza oxidarea grupei geminovoy de substraturi adecvate (benzidina, rasina gvoyakovaya) peroxid de hidrogen.

Reactivi. Peroxidul de hidrogen, 3% proaspăt soluție preparată; benzidină, proaspăt preparată soluție 5% în acid acetic glacial; Acid rășină guaiac, soluție 1% în etanol 95%, preparată proaspăt; acid azotic, conc.; acid clorhidric nu conține fier, soluție 10%; hexacianoferat (II) de potasiu, soluție 2,5%; tiocianat de amoniu, soluție de 1%; hidroxid de sodiu, soluție 3%; reactiv biuret *; acetonă, se acidulează cu acid clorhidric (3 ml de soluție de HCI 2 M în 1 litru de rN≈2 acetonă) răcită într-un frigider.

Echipamente. Benzi de lățime hârtie de filtru de 1 cm; pipetă oculară; pipetă 1 și o capacitate de 10 ml; trepied; tuburi simple și centrifugare; baie de apă și nisip; Greutăți centrifuge de centrifugare; creuzet de porțelan și cleștele creuzet.

1. sânge integral diluat de 5000 de ori cu apă distilată.

2. Sânge defibrinat.

3. Hemoglobina cristalin 1% soluție apoasă.

a. test de Benzidină pentru grupul hemoglobinei geminovuyu. Metoda se bazează pe abilitatea grupurilor geminovoy hemoglobinei catalizează reacția de oxidare benzidina cu peroxid de hidrogen în difenohinondiimin

Difenohinondiimin condensat cu o formă neoxidată benzidina moleculă un complex colorat cu o culoare albastru-verde.

Țeava de turnare 1 ml de sânge integral diluat în 5000 de ori, fierte timp de câteva minute într-o baie de apă, se răcește și se adaugă la 2 picături de benzidină și peroxid de hidrogen. Notă aspectul de colorare.

b. test de guaiac pentru grupul hemoglobinei geminovuyu. Metoda se bazează pe abilitatea grupurilor geminovoy hemoglobinei catalizează oxidarea guaiac de peroxid de hidrogen ozonidei rășină acidă colorată în albastru.

Cursul de determinare. Tubul realizat de câteva picături de sânge integral (diluat de 5000 de ori) și încălzit-l timp de 1 minut într-o baie de apă. După răcire, proba se toarnă într-o soluție alcoolică de 1-2 picături de acid rășină guaiac și 3 picături de soluție de peroxid de hidrogen. Notă colorare de dezvoltare.

în. Testul cu hexacianoferat (II) tiocianat de potasiu și fier de amoniu în hemoglobină. Metoda se bazează pe abilitatea fierului incluse in hemoglobina, pentru a forma un hexacianoferat (II) de potasiu, în prezența acidului clorhidric, compusul complex albastru-verde - albastru de Prusia:

hexacianoferat (II) de Prusia

si cu tiocianați - roz sau roșu de fier tiocianat:

Cursul de determinare. Câteva picături de sânge defibrinat a fost plasat într-o ceașcă de porțelan (Cupa), și se evaporă la sec pe o baie de nisip. reziduu calcinat uscat, se adaugă 2-3 picături de acid azotic concentrat și se continuă încălzirea (sub o hotă). Astfel, fierul din hemoglobina continuă cenușă.

Reziduul uscat este reluat într-un tub de testare a fost adăugat 10 picături de acid clorhidric pentru a dizolva cenușa. Se toarnă conținutul aproximativ egal în două eprubete. Unul dintre ei a fost adăugat 2 picături de soluție de hexacianoferat de potasiu (II). Observați apariția colorării caracteristice. Al doilea tub 2 picături turnat soluție de tiocianat de amoniu, și marchează dezvoltarea de colorare specifică.

Separarea hemoglobinei la heme și globinei. Metoda se bazează pe capacitatea de acetonă, se acidulează cu acid clorhidric, pentru a rupe legătura dintre hem si globina, fulgii de hem dizolvați în acetonă, iar globina este precipitat.

Cursul de determinare. Tubul se toarnă 10 ml de acetonă și se acidulează încet adăugat 10 picături de soluție de hemoglobină. Urmărirea suspensiei albicios aspect (globină) care stabilește treptat. Conținutul tuburilor a fost agitat cu o baghetă de sticlă, se transferă în tuburi de centrifugă și se centrifughează la 1500 rot / min timp de 5 min.

După centrifugare, stratul superior (acetonă) a fost coborâtă cu atenție două benzi de hârtie de filtru și de a face o reacție la gruparea prezență geminovoy. În acest scop, o bandă este aplicată benzidina în picături și soluție de peroxid de hidrogen (testul benzidină), a doua două picături de acid fursecuri alcoolic rășină soluție guaiac și soluție de peroxid de hidrogen (testul guaiac). Notă apariția treptată a unei colorație caracteristică atât benzile de hârtie.

Lichidul supernatant se decantează cu grijă și precipitatul rămas s-a adăugat la 1 ml de soluție de hidroxid de sodiu 3%. Se amestecă conținutul și se adaugă 10 picături de reactiv biuret. Observați apariția unui colorit caracteristic.

Efectuarea de lucru. Rezultatele iau forma unui tabel.

Rezultatele indica posibilitatea de a detecta hemoglobină în materialul prin reacțiile calitative efectuate și separarea componentelor sale, acțiunea soluțiilor acide acetonă; accentuează importanța reacțiilor la practica.

Semnificația practică a lucrării. Principala parte a sângelui gemproteidov este sub forma unei hemoglobina eritrocitelor. Serul sau plasma conține numai o mică cantitate gemproteidov, în curs de dezvoltare cu o descompunere considerabilă de celule roșii sanguine (hemoliză). Fierul seric este sub forma ferrotransferina sunt complexe de proteine ​​(metaloproteinelor) care transportă fier între țesuturi și organe.

Grupuri de reacție prostetică calitativă proteide dezvăluie componentele structurale: rest geminovuyu și care face parte din fier hem. Pentru a detecta urme de sânge sunt foarte sensibile teste Benzidină și guaiac utilizate în investigațiile clinice și medico-legale.