Diagnosticul de viruși
Tehnici de cultivare a virusului
Pentru creșterea culturilor de celule, folosind o compoziție complexă mediu de alimentare LARG care cuprinde surse de energie, minerale, aminoacizi, vitamine și alte
factori de creștere. Celulele sunt extrem de sensibile la pH-ul de schimbare-Niju. Pentru controlul pH-ului sunt adăugate la mediul de afișare. Cele mai multe celule. culturi în creștere ca monostraturi (plas-una constând dintr-un singur strat de celule), fixat ferm pe suprafața containerului pentru cultivarea - tuburi, plăci din material plastic sau saltea) (flacon cu 4 fețe noi vor). Unele tipuri de celule capabile să crească în susp-sion.
Prepararea celulelor kultty primare cuprinde non-multe etape succesive: mărunțirea țesutului, celulele conector unire prin spălarea tripspozitsii rezultând suspensii omogene de celule izolate din tripsină, urmată de suspendarea celulelor într-un mediu nutritiv oferind o creștere a acestora (de exemplu, 199 mediu suplimentat cu ser de vițel) . Când sedimentarea celulelor, mai degrabă ferm atașat la peretele tuburilor sau sticle, care sunt distribuite într-un monostrat. După obținerea unei celule viabile de cultură monostrat sunt infectate cu sale mate-riali care conțin viruși. UPR-menționat-microbii pătrund în celule, unde se vor multiplica, ele sunt. În celula culturi reușesc să cultive cele mai multe virusuri care cauzeaza boli umane.
paraziți intracelulari au acțiune dei citopatic (CPE) pe celule, care are loc în reproducerea lor. CPE se poate manifesta distrugere (liza) a celulelor infectate, modificări în morfologia lor (schimba marimea si forma celulei, apariția vacuolelor și incluziuni care reprezintă acumulări intracelulare virusuri formează oschtsitiya) și încălcarea funcțiilor lor.
embrioni de pui. embrioni de pui în comparație cu culturile de celule sunt mult mai puțin contaminate cu viruși, și, de asemenea, comparativ înalt, dar vitalitatea și rezistența la diferite influențe. Acestea sunt virusuri dlyanekotoryh adecvate care sunt patogene pentru om.
Pentru a obține culturi pure de Rickettsia, Chlamydia și numărul de viruși în scopuri de diagnosticare, de asemenea. De asemenea, pentru prepararea diferitelor ispol'uet formulări (vaccinuri, Diagnostica), formează o 8-12 zile a embrionilor de pui. Dezavantajele Danno tehnica th includ incapacitatea de a detecta microorganismului testat fără disecția prealabilă a embrionului, iar prezența unui număr mare de proteine și alte depozite de legătură purificare ulterioară complicarea a agentului în fabricarea diferitelor preparator
Pentru a infecta materialul de testare embrion de pui introduse în cavitățile alantoidian și amniotic on-corionul membrane alantoidian sau în sacul vitelin al unui embrionat (Fig.). Pentru infecție în cavitatea alantoidiană în învelișul peste celula de aer (limitele de creion sale DYT pre-obvo la ouă lustruirii), do-deschidere mare nu cu foarfeca, un scalpel sau sfredel-spe cial. Utilizând o seringă injectată 0,1-0,2 ml de material conținând virus la o adâncime de 2-3 mm sub camera-aerisit clorhidric limită. Gaura din mantaua este umplut cu parafină topită. embrioni Autopsie infectate produse în ceea ce privește acumularea maximă a virusului (48-72 h in-kubatsii la 37 ° C). După tratamentul cu soluție de alcool și 2% coajă iod disecat cu foarfeca puțin peste granițele camerei creion aer clorhidrici conturate, înclinarea oului astfel încât să se evite căderea în cavitatea mantalei. Shell aruncat, îndepărtați cu grijă teacă și considerând-a dizolvat shell-chorio alantoamniotic in jurul locului de infecție, cu-mechaya prezența sau absența leziunilor. - Hemoragie, placi, etc Apoi pipetă Pasteur pierce-chorio alantoidian coajă în zona liberă a vaselor sanguine și fluid alantoidian a fost aspirat. recuperat Ulterior membrană ho Rion-alantoidian, a fost spălat de două ori cu soluție izotonă-cal de clorură de sodiu, a fost plasată într-un vas Petri și se notează pe o prezență fundal negru de leziuni specifice.
animalele de laborator. Specii de animale susceptibile, vârsta lor de reproducere determina virusurile cale-Ness. In multe cazuri, singurul nou-născut Ms-votnye sensibile la un anumit virus (cum ar fi sug mouse-ul pentru virusul Coxsackie). Avantajul metodei de cultivare a paraziților intracelulari sau în obligatorii ai organismelor la animalele de laborator peste celălalt este o selecție coș-Moznosti acelor virusuri care sunt ruyutsya slab-reprodutsi în culturi de celule sau embrion. Dezavantajele sale includ o mare probabilitate de contaminare a organismului la animalele dopytnyh virusurile străine și micoplasmelor, precum și necesitatea de contaminare ulterioară a culturii lipici-curent pentru a obține o cultură pură a virusului care Uwe-lichivaet termeni de cercetare.
viruși afișa metode. Pentru a demonstra prezența sub-virusului în culturi celulare, folosind mai multe metode.
I. Pe reproducere (reproducerea) virusurilor în culturi celulare este evaluată prin efectul tsitopatteskomu (CPE), care poate fi detectată prin morfologic microscopică a celulelor Menen.
a) Unele dintre aceste celule sunt ucise și desprinsă de pe pereții tubului. b) particule virale eliberate în timpul distrugerii unor celule infectate cu alte, care după un anumit timp, de asemenea, pier. Ca urmare, în loc de complet picior monostrat de celule sunt doar câteva insule kletoch Nye.
CPE Caracter cauzate de virusuri diferite, nu același lucru. Când reproducerea unor virusuri (paramiksoviru-si, herpes) observat fuziunea celulară pentru a forma syncytia, altele (enterovirusuri, reovirusuri) - ridarea și distrugerea celulelor, a treia (adenovirus) - agregarea celulelor. CPE virus a fost evaluat în dinamică, în căutarea de cultură a celulelor la microscop la momente diferite după infectarea materialului care conține virusul. Nu-ca virusurile (enterovirusuri, virusuri herpes) cauza CPE timp de 1-2 zile, altele - la o dată ulterioară (4 ^ -6-a zi). DPC caractere utilizat pentru detectarea virușilor (afișare) și indicativul de identificare, adică, op-definiteness speciei.
Unii viruși pot fi detectate și identificate prin incluziuni că ele formează în nucleul sau citoplasmă celulelor infectate. Incluziuni formă diferită, și intervalul de dimensiuni de la 0,25 până la 25 microni. Ele sunt locuri în care particulele de virus și pot fi identificate prin prep minute preparat din țesutul infectat și colorat cu fluorocromi. În acest din urmă caz, se utilizează un microscop fluorescent.
Pentru studiile de morfologie celulară contaminate folosesc un microscop inversat special, Iluminatorul co-torogo este pe partea de sus și lentile - din partea de jos a scenei. Cu un astfel de dispozitiv, este posibil să se evalueze morfologia celulelor în creștere ca monostrat pe suprafața recipientului de cultură. Kie modificări morfologice ale celulelor a fost detectată de cis folosind lentile de microscop de cultură aderență 8x sau 40x. Atunci când se compară monostratul de celule infectate cu virusul la celulele neinfectate din eșantionul de control au rezervor plin sau distrugerea celulelor insulare sau a altor modificări care caracterizează CPE virusului. Pentru un studiu mai detaliat al CPE în recipientul de cultură plasată coverslip pe care se formează monostrat. Ulterior, sticla este îndepărtat, celulele infectate au fost fixate și de preparat droguri microscopice care sunt fluorocrom-pete, etc.), și de a studia metoda scufundare.
CPE virus poate fi, de asemenea, demonstrată prin „proba de culoare“: celule active metabolic în cultura vieții secreta alimente acide, te leagă, schimbarea culorii indicatorului prezent în mediul de cultură. În cazul în care reproducerea celulelor virusului își pierd capacitatea de a metaboliza și să moară, astfel încât mediul de colorare nu se modifică în timp.
II. De gemadsorbtsii de reacție utilizate pentru a indica virusurile GEMAG-glyutiniruyuschih. Reacția se bazează pe capacitatea suprafeței celulei, care sunt reproduse astfel de viruși adsorb eritrocite. Pentru armarea gemad reacția sorbție la cultura celulelor infectate cu virusuri, a fost adăugat eritrocitele suspensie și după un anumit millstands-ki timp de contact se spală cu soluție de clorură de sodiu izotonică. Pe suprafața celulelor infectate cu viruși rămân eritrocite-Chiyah blocat.
III.Reaktsiyu hemaglutinarea (DSA) este utilizat pentru virusurile antihemaglutinante obna-lichid de cultură în apărarea bunului sau celule de cultură infectate sau lichid amniotic embrionat corioalantoica. Hemaglutinarea - „lipirea“ a celulelor roșii din sânge din diferite specii de animale (pui, gâște, porci de guineea) - cauzate de un virus care conține vobolochke hemaglutinina. Pentru stabilirea reacției gemagglyuti-națiune la materialul de testat într-o suspensie de celule roșii din sânge. În prezența virusurilor aglutina eritrocitele.
3, etc. Pentru titrului Niemann-WGA la diluție maximă la care se observă hemaglutinare (++). Titrul de DSA descrie activitatea virusului și este utilizat în formularea HI.
Pentru detectarea cantitativă a particulelor virale este-polzujut metode de titrare. Titrul virusului poate fi determinat în hemaglutinare cu diluții de 10 ori-cul pozitiv mediu întreg sau material al embrionului de pui sau de CPE în culturi celulare. În acest ultim caz, celulele de cultură sunt infectate cu diluții de 10 ori dintr-un material care conține un virus. După o incubare de 6-7 zile de navigare pentru prezența CPE. Pentru titrului virusului luând cea mai mare diluție care produce CPE în 50% din infectate cul-rotund. Titrul virusului este exprimat cantitatea de citopatic doze (infecțioase) (ID5 on)
-O mai precisă metodă de contabilitate cantitativă NYM departament-TION de particule virale este o metodă de plăci Xia. cultura de celule inoculate cu virus, și tonul de acoperire strat Kim de agar. După în-kubirovaniya culturile în Techa-set pentru câteva zile într-o porțiune de suprafață de agar apar sub formă divizată descuraja iluminați (plachete) sunt zone de celule moarte in cultura de celule monostrat complet-prefectura. Fiecare placă este formată prin multiplicarea unei particule vee niveluri și este clar vizibil ca lumină secțiune circulară pe fundalul roșu al celulelor colorate cu roșu neutru in vivo. Titrul virusului, acest set-UI Todd, exprimă numărul de unități formatoare de plăci (PFU) în 1 ml. Mărimea, morfologia și calendarul plăcilor Diverse chayut-nu numai în diferite specii de virusuri, dar, de asemenea, de la tulpinile individuale ale aceleiași specii. Aceste semne sunt utilizate pentru selectarea tulpinilor și pregătirea așa-numitelor linii curate-Mykh virusuri.