Secventierea genomi de simplu

Pentru a determina secvența de nucleotide (E. Structura primară și anume.) Dintr-o anumită regiune a ADN-ului este mai întâi necesar să se simplifice, care se realizează prin tăierea în bucăți de relativ scurt. Acest lucru se poate face, de exemplu, prin intermediul „scalpel“ special la ADN - enzime de restricție, care au fost deja discutate mai sus.

Sequencing protozoare, al cărui genom este relativ mic, de obicei folosesc o procedură numită condițional „în jos“. Toate ADN-ul „tăiat“ în bucăți, folosind enzime deja menționate mai sus enzime de restricție, apoi secvențiată aceste piese separat, iar apoi „lipite“ sunt genom complet. „Lipirea“ a originalului se realizează prin faptul că secvențele de nucleotide ale diferitelor secțiuni sunt suprapuse una cu cealaltă, adică. E. Capetele sunt identice. Această metodologie se numește „pusca“. Esența acestei proceduri este reflectată în Fig. 16.

Fig. 16. Schema de strategie „shotgun“ utilizată pentru secvențarea molecule mari de ADN

Cu toate acestea, în cazul unor astfel de genom foarte complexe cum ar fi genomului uman, am început cu o alta, și anume determinarea poziției de gene cunoscute si a altor markeri genetici pe cromozomii individuale, adică cu cartografierea genetică a genomului. Similar sarcinii experimente genetice pe obiecte mai simple încă mai încearcă să decidă T. Morgan, care pentru activitatea sa a câștigat Premiul Nobel în 1933. Acum, există metode mai eficiente. Unul dintre ele, numită metoda „hibrid radiații“ este după cum urmează. celule umane in crestere in vitro într-un mediu de cultură este iradiat cu raze X, ceea ce duce la moartea celulelor care rezulta din pauza ADN cromozomial în bucăți cu 2.5-25 Mill. n. n. Dar, înainte de celulele moarte de iradiere dezintegra, acestea sunt fuzionate cu celule de hamster, rezultând în celule diferite de hamster obține un set diferit de fragmente de ADN uman. Apoi, celulele „hibride“ sunt extinse în cultură, cu ei, împreună cu propriul lor ADN-ul este replicat și fragmente de ADN străin. Apoi determină compoziția de gene cunoscute si a altor markeri genetici în fiecare linie celulară, și prelucrarea statistică a datelor obținute, cel mai probabil deriva poziția lor relativă în cromozomi. Utilizarea ca gene și fragmente de ADN ale functiei necunoscute ca markeri genetici. Pentru markeri de cartografiere cromozom proprietăți importante este polimorfism lor, adică. E. Existența diferitelor forme între indivizi.

Deoarece primele hărți genetice ale genomului uman au fost construite care a fost marcată inițial diferiți markeri genetici sunt distanțate cu o distanță de cel mult 2 milioane de perechi de nucleotide (mln. N. N.).

În continuare, hărți fizice au fost trase de cromozomi: inițial, cu o rezolutie de 0100000 n .. n. și apoi 0,001 Mill. n. n. În acest scop, într-o primă etapă, metodele de colorare cromozomiale utilizate și hibridizare cu cromozomi in situ. Acesta a fost folosit doar ulterior cu enzimă de restricție. Cu ajutorul acestor enzime lucrează surprinzător de bine „zdrobit“ ADN în conformitate cu zone bine definite pe milioane se suprapun reciproc în fragmentele de secvență nucleotidică „dezasamblate“ fiecare dintre ele separat, iar apoi sunt „lipite“ original. „Lipirea“ a fost realizat pe baza unor fragmente suprapuse ale secvenței de nucleotide. A mers treptat, mai mare și mai mare. Prin urmare, această strategie se numește „bottom-up“. În mod clar putem spune că a rezolvat o scară mare și complexitatea sarcinii. Și pentru a rezolva, oamenii de știință au putut doar cu ajutorul supercomputere. Ca rezultat, hărți fizice au fost create de regiuni diferite de ADN și cromozomi întregi, constând dintr-o serie de suprapunere reciproc fragmente. Un set de fragmente "înrudite" numite contig (Fig. 16).

După apariția unor metode eficiente de strategii de secventiere ADN și utilizarea multiplă a acestei metode a fost crește rapid cu ax transcrise secvențe de nucleotide organisme în principal simple, cum ar fi virușii, precum și fragmente individuale ADN donate ale diferitelor specii de organisme. Astfel, la sfârșitul anilor 1970 a fost rezolvată structura primului obiect viu - bacterii virus - desemnate ca bacteriofagi. 174, având o lungime de 5386 n. N. Apoi am urmat toți ceilalți.

Primele obiecte au fost selectate pentru secvențierea din întâmplare. Cele mai multe dintre aceste microorganisme (archaebacterii, spirochete, hlamidobakterii, E. coli, agenți patogeni pneumonie, sifilis, hemofilie, bacteriile producătoare de metan, micoplasme, rickettsii, cianobacterii) sunt capabile de a provoca o varietate de patologii la om. În prezent, multe dintre aceste proiecte au fost deja finalizate; Am investigat mai mult de 800 de gene complete de celule mycoplasma, Archaea, E. coli, agenți ai unui număr de boli umane, precum și drojdie de panificatie, un vierme mic-nematod, zbura de fructe și foarte interesant în plante practice termeni Arabidopsis. Este foarte probabil ca numărul real de genomi esalonate in prezent de mult mai mult, deoarece multe companii farmaceutice pentru a clasifica rezultatele lor, nu prin publicarea lor în presă.

Tabelul 2. Unele genomilor microorganisme secvențiate complet până în prezent

Ponderea pe pagina