O metodă pentru inhibarea activității hemolitice a tulpinilor patogene E. coli

Invenția se referă la medicină și pot fi utilizate pentru a suprima activitatea hemolitică a tulpinilor patogene de E. coli. Pacientul este administrat o soluție de argint electrolitic într-o concentrație de 0,5-5,0 mg / l pentru 2-9 zile. Solutia este folosita atat in mod independent si simultan cu antibiotice. Metoda permite neutralizarea hemolizinei tulpinile patogene de E. coli. Acest lucru crește eficacitatea tratamentului. 2 ZP f CONTEXT Tabelul 3.

Invenția se referă la medicină, medicină veterinară, microbiologie, si poate fi folosit, de exemplu, în chirurgie și în agricultură pentru tratamentul infecțiilor chirurgicale de exemplu purulent și complicațiile lor cauzate de microflora având activitatea hemolitică.

Urgența problemei, datorită faptului că, în prezent nu există medicamente având activitate antihemolytic și sunt utilizate în practica medicală, în timp ce, de exemplu, este un factor major -gemolizin patogene E. coli. tulpini producătoare de hemolizină este adesea distins de pacienți cu infecții ale vezicii urinare, bacteriemie, septicemie, meningita și aproape nedetectabile în flora fecale umane normale (2).

Capacitatea multor tulpini de E. coli provoca hemoliza umane și animale datorită prezenței în celulele genei -gemolizina E.coli care codifică o proteină de toxină în masă de 107 kD. Toxina este capabil de a nu numai lizează celulele roșii, dar și prin distrugerea membranelor celulare au efecte citopatice asupra celulelor epiteliale renale, neuroni, leucocite, fibroblaste, monocite (1, 2, 5).

Hemolizină este cel mai studiat toxina (3, 7). Dar sunt încă puțin înțelese și dezvoltate metode de a reduce activitatea hemolitică și să neutralizeze acțiunea patologică a acestei toxine.

Pentru o serie de alte substanțe hemolizinei stabilit care inhibă acțiunea lor și care cauzează prevenirea efectului hemolitic. Astfel, acesta inhibă acțiunea hemolizine lecitina streptococilor din grupele A și B (4), iar activitatea -toksina stafilococice și b-lizina scade concentrațiile brusc scăzute de fosfatidilcolina. toxina delta stafilococică nu prezintă proprietăți hemolitice ale fosfolipide naturale în prezența (9). Potrivit lui O. Tsiganova fosfolipide hemolizine mecanism de supresie este în încălcare a toxinelor interacțiune cu membrana eritrocitară (8). Unul dintre cei mai activi inhibitori ai hemoliza este colesterolul inactivare hemolizinei Yersinia pestis, hemolizine O2 -labilnyh (9). O serie de substanțe împiedică procesele de fixare hemolizine stafilococi asupra celulelor țintă - acest konkovalin Un tanin (prevenind legarea aureus -toksina); gangliozide Gti și Gdta.

În ceea ce privește -gemolizina E. coli, efectul inhibitor asupra hemolizei sub influența toxina are EDTA și unele anestezice locale (10). Aceste substanțe nu pot fi utilizate pe scară largă în clinică pentru a bloca reacțiile hemolitice ca au o serie de efecte secundare și nu înseamnă tratamentul infecțiilor bacteriene (6).

În legătură cu detectarea substanțelor care împiedică dezvoltarea reacțiilor hemolitice, nu numai că va permite să se dezvolte modalități de a face cu tulpini hemolitice, dar, de asemenea, să conducă la o înțelegere a naturii chimice, mecanisme de acțiune și interacțiune a toxinelor din celule.

Metoda cunoscută de inhibare a activității hemolitice a E. coli prin utilizarea unei soluții electrolitice de hipoclorit de sodiu (Petrosyan EA și colab., „Efectul oxidării electrochimice a anumitor proprietăți ale E. coli.“ Rep. Proc. Scien. Tr. „infecții enterice acute“, L. 1988 vol. 12, pp. 57-59). Metoda adoptată de noi ca un prototip. Această metodă este caracterizată prin aceea că, E. coli după tratare cu o soluție de hipoclorit de sodiu electrolitică pierde capacitatea de a induce hemoliza eritrocitelor. Cu toate acestea, deficiențele procesului se numără faptul că hipocloritul de sodiu se poate determina hemoliza eritrocitelor.

Prezenta invenție evită efectele secundare nedorite ale altor medicamente, și de a spori expunerea la activitatea hemolitică a E. coli prin utilizarea soluțiilor de argint electrolitice cu o concentrație de 0,5-5,0 mg argint / litru.

Obiectivele invenției sunt: ​​oferta de preparare -gemolizina activitate suprimarea, care este principalul factor in patogenitatea E. coli, asigurând astfel reducerea complicațiilor, reducând severitatea și durata tratamentului proceselor chirurgicale purulente cauzate de E.Coli.

Invenția constă în suprimarea activității hemolitice a tulpinilor patogene de E.Coli cu introducerea unor soluții electrolitice de argint, cu o concentrație de 0,5-5,0 argint mg ​​/ litru. Expunerea poate fi efectuată în asociere cu alte medicamente si terapie autoadministrare a soluției de argint electrolitic. Durata tratamentului este determinată de tabloul clinic al bolii și poate varia de la 2 până la 9 zile. Având în vedere lipsa de nocivitate a preparatului (12) în conformitate cu tratamentul indicațiilor poate fi continuată.

Procedeul se realizează după cum urmează.

Prin examenul bacteriologic determinat prezența E. coli, având proprietăți hemolitice. soluție de argint electrolitica într-o concentrație de 0,5-5,0 mg / l se administrează intravenos o dată pe zi, și (sau) prin rana de irigare de două ori pe zi, în timpul tratamentului cu antibiotice. Atunci când se administrează intravenos la ser de argint electrolitic într-un volum de 500 ml.

Pentru a demonstra autenticitatea reducerea activității hemolitice a microflorei utilizate tulpini de Escherichia coli cu plasmidul hemoliză. In prezentul studiu am folosit plasmid DII l / MD 13,1 /, care cuprinde hemolitic determinant plasmida naturală pSF200 Hlv 212 clonat în vectorul pBR325 (5,11). Ea a avut de 8-10 ori mai multă activitate hemolitică decât tulpina mamă naturală. plasmid PRDI a fost introdus în tulpina E.coli DH1 (F, rec Al și Al, Gyr A96, thi-1, hsd 17 (RC-, mc +), sup E 44, rec A 1. -) (10) prin transformare. Pentru creșterea tulpinii utilizat un bulion de carne-peptonă și agar simplu, mediu M9.

Determinarea activității hemolitice a fost realizată după cum urmează.

1. Prepararea suspensiei eritrocitare: de sânge de iepure nitrat a fost spălat de trei ori în NaCl izotonică. Suspensia este introdusă în eritrocit la tampon hematiilor: 10 mM Tris HCI, 7,5 10 mM CaCI 0,9% NaCl la o concentrație de 1%.

2. O cultură de peste noapte a tulpinii din BCH pRD1 au fost crescute în faza de creștere exponențială (OD 540 = 0,5).

3. Celulele au fost peletizate cultură într-o centrifugă la 3 mii. 15 min și supernatantul conținând -gemolizin a fost examinată metoda diluției pe activitatea hemolitică.

4. supernatant pRD1 / DH1 lichid cultură diluată în două diluții în bulion, apoi se adaugă o suspensie de eritrocit 1%. Amestecul a fost incubat timp de 1 oră la 37 ° C într-o baie de apă. A servit ca tuburile de control conținând suspensia eritrocitare fără supernatant (K) și 1/2 V ca suspensii eritrocitare fără supernatant (50 K).

5. Măsurarea eritrocitelor rămase densitate celulară efectuate spectrofotometru (OD-620 nm) (5, 7).

6. Pentru a determina efectul argintului asupra activității hemolitice se administrează în plus soluție de argint electrolitic într-o concentrație de 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 mg / l.

Rezultatele experimentelor folosind soluția electrolitică a argintului, la o concentrație de 0,5 mg / l sunt prezentate în tabelul 1.

Activitatea hemolitică a probelor este exprimat unitate hemolitice arbitrar (HU), care a fost determinată ca ultima diluție la care există 50% liza eritrocitelor (11).

După cum se vede din tabel, activitatea supernatantului în prezența unor soluții electrolitice de argint (concentrație inițială - 0,5 mg / l), exprimat ca NO, este - HU 8 și diferă de control în care activitatea hemolitică este 128-256 HU. Prin urmare, a existat o scădere bruscă a capacității E.coli -gemolizina liza celulelor roșii din sânge în prezența ionilor de Ag ++. Tabelul 2 prezintă rezultatele activității hemolitice schimbă tulpini patogene de E. coli sub influența diferitelor concentrații de soluții electrolitice de argint: 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 mg / l.

Din aceasta putem concluziona că soluția electrolitică a argintului este o substanță capabilă să prevină liza eritrocitelor patogene E. coli, care poartă determinant hemolitic. Mecanismul acestei acțiuni nu este cunoscută, dar soluția electrolitică de argint poate avea o sarcină pozitivă, schimbarea conformația -gemolizina situs activ care interferează cu interacțiunea toxinei la membrana celulei țintă și formarea canalelor. Nu se poate exclude influența medicamentului pe membrana eritrocitelor care duce la măsurarea taxei structurilor de suprafață implicate în primirea toxinei.

Neutralizarea efectelor toxice ale electrolitici experimentelor ARGINT soluție -GEMOLIZINA au fost efectuate pe șoareci cântărind 20-30 g au fost utilizate două grupe de animale de 15 animale fiecare.

I Series. Și 5 șoareci au fost injectați cu supernatantul fluid de cultură PRDI (OH1) la mediu glyukozomineralnoy Mg (compoziție în g NH4Cl - 1,0; NaCl - 0,5; NaHPO - 6,0; KHPO - 3,0; MgSO - 0,2 ; glucoză 4,0; apă distilată până la 1000, pH - 7,2) - într-o cantitate de 500 microlitri intraperitoneal.

SERIES II. A introdus succesiv 500 microlitri de supernatant și 35 microlitri de soluție de argint electrolitic, cu o concentrație de 0,5 mg / l).

seria III. 500 microlitri de mediu M9 + 35 microlitri NaCl.

Rezultatele experimentelor sunt prezentate în tabelul 3.

După cum se vede din tabelul 2, soluția electrolitică a argintului cauzat creșterea supraviețuirii șoarecilor pretratate supernatant administrat intraperitoneal conținând -gemolizin. Aceasta indică faptul că soluțiile electrolitice de argint au antigemolicheskoy activitate și pot fi folosite pentru tratarea infecțiilor cauzate de tulpini hemolitice de Escherichia coli.

Metoda a fost testată într-un cadru clinic la 5 pacienți. Astfel, într-un caz, soluțiile electrolitice de argint au fost administrate intravenos și concomitent efectuat spălarea cavității abdominale.

Exemplul 1. Un pacient de 62 de ani asupra procesului tumoral efectuat gastrectomia subtotală și rezecție proximală a cozii pancreatice. Perioada postoperatorie a fost complicată de dezvoltarea articulatiilor insolvabilitatea duoden, peritonite, formarea de abcese a cavității abdominale și dezvoltarea condițiilor septice. Tratamentul cu antibiotice, inclusiv penicilina, ampicilina, kefzol, tseporin, a adus nici un efect. cercetare bacteriologică a aratat detașabil abdominale E. coli, având proprietăți hemolitice și nu sunt sensibile la antibiotice. Pentru sănătate atribuite administrarea intravenoasă a 500 ml de soluție electrolitică pe soluție salină de argint (concentrație de 5 mg / l) în timpul tratamentului cu 12 Mill. U. penicilină pe zi. În termen de două zile, temperatura a fost normalizat. Introducerea de soluție electrolitică de argint a durat 9 zile. Prin ziua a 12-a stării pacientului a fost satisfăcătoare.

Exemplul 2. Un pacient de 65 de ani, care suferă de diabet, amputarea piciorului inferior după o intervenție chirurgicală în treimea superioară, a produs aproximativ gangrene dezvoltat răni purulente și starea septică. Semănatul în rana a arătat prezența tulpinii E. coli hemolitic. Utilizarea antibioticelor nu a produs un efect pozitiv. Administrarea intravenoasă atribuită de 500 ml de soluție electrolitică pe soluție salină de argint (concentrație de 0,5 mg / l). Pe parcursul a 3 zile, temperatura a fost normalizat. Introducere soluție de argint electrolitică a fost continuată timp de 2 zile. În același timp, de 2 ori pe zi, efectuate înfășurată electroliza irigarea soluției de argint. starea pacientului sa stabilizat. Rana a fost curat și, ulterior, pacientul a fost externat în stare satisfăcătoare.

Noutatea metodei constă în faptul că utilizarea soluțiilor de argint electrolitice permite obținerea unor efecte pozitive neașteptat de ridicată datorită utilizării combinate a antibioticelor și soluții electrolitice de argint sau ca o formulare separată.

Astfel, metoda propusă permite să influențeze în mod eficient microflora având activitatea hemolitică, conducând la o pondere semnificativă a procesului de bază. O metodă utilizată în practica medicală pentru a neutraliza interacțiunea reacțiilor patologice N1u + tulpinilor de E. coli cu corpul pacientului, pentru a aplica substanța ieftină și eficientă disponibilă care inhibă acțiunea hemolizinei. Metoda evită posibilele complicații și de a reduce semnificativ timpul tratamentului.

REFERINȚE 1. Hugnes C.D. Muller, J. Hacher și W. Loebel, 1982, genetica si rolul patogenic Escherichie coli hemolizinei. Toxican 20, p. 247-257.

2. H. W. Smith, H.B. Huggins. Rolul toxic al Alphahaemolisin in patogeneza infectiei experimentale E. coli la șoareci. J. Gen Microb. 1985, 131, p. 395-403.

3. J. Hacher, H. Hof, L. Emody și Loebel. Influența Escherichia coli clonate henes haemolisin, fimbria S. și rezistența ser asupra patogenității, la modelele animale ditterent. Microbiol. Patogeneza, 1986, N 1, p. 1533-1547.

4. Bornside Cr. Bois P. J. Coch J. Hemoglobina și E. coli, o complination intraperitoneal Letal. J. Bacteriol. 1968 N 5, p. 1567-1571.

5. Rault M. M. stuning și W. Konig. Metabolizarea leucotriene de 1-glutamyltranspeptidase și dipepsidase din granulocites clare polimorphonu umane. Imunologie, 1985, N 55, p. 135-137.

7. Mackman N. Holland J.B. Secreția unei polipeptide 107 daltoni în mediul dintr-o haemolytise E. coli K 12 tulpina Mol Gen Jenet. 1984, 193, p. 312-315.

8. OI Tsyganov. hemolizinei bacteriană și relația lor cu virulență. Stavropol. MM 1982.

9. L. Romanova, BI Mishankin, AN Kravtsov. Clonarea moleculară și expresia Hly genelor de E. coli. genetica moleculara, microbiologie, virusologie, 1984, 2, 34.

10. T. Maniatis, E. Fritsch, J. Sambrook. Clonarea moleculară. Mir, 1984

11. Kulsky LA Apa de argint. Kiev. "Naukova Dumka", 1987

1. Metodă pentru suprimarea activitatii hemolitică a tulpinilor patogene de Escherichia coli, care cuprinde utilizarea unei soluții electrolitice, în care pacientul este administrat o soluție de argint electrolitic într-o concentrație de 0,5-5,0 mg / l.

2. Metodă conform revendicării. 1, caracterizat prin aceea că soluția electrolitică a argintului administrat concomitent cu antibiotice.

3. Metodă conform revendicării. 1 și 2, caracterizat prin aceea că soluția electrolitică a argintului administrat timp de 2-9 zile.