Imunitatea dobândită - anticorpi sinteza - bazele de imunologie

Detectarea și cuantificarea celulelor care formează un anticorp

imunofluorescență

Celulele din citoplasmă care conțineau anticorpi pot fi identificate prin „sandwich“ (vezi. Fig. 5.20, e). De exemplu, în cazul în care celulele producătoare de anticorpi la toxoidul tetanic, pretratate antigen și apoi cu anticorpi marcați cu fluoresceină la toxoidul, acestea sunt ușor de detectat de către un microscop fluorescent.

Metoda de hemoliza locale

Cele mai frecvent utilizate hemoliza locală întruchiparea bezgelevy care este o modificare a metodei propusă inițial de Jerne și Nordin. Această modificare constă în faptul că celulele animale imunizate cu eritrocite de oaie sunt suspendate împreună cu un exces de eritrocite și un complement în camera îngustă formată din două lame. În timpul incubării, celulele care produc anticorpi care secreta imunoglobulina lor care se leagă de eritrocite din jur. Complement cauzează liza eritrocitelor, și în jurul fiecărei celule producătoare de anticorpi așa-numita „directă“ zona hemoliza liberă a eritrocitelor (fig. 7.1). Tehnica descrisă este destinată în primul rând pentru detectarea producerii IgM, deoarece acești anticorpi au o activitate hemolitică ridicată. Pentru a identifica celulele sintetizare IgG, trebuie adăugat la IgG antiser de iepure. Complexe anti-globulină și anticorpi eritrocitare activează complementul și pot provoca formarea așa-numitelor zone „indirecte“ de hemoliza.

Fig. 7.1. Metoda Jerne a hemolizei locale într-o modificare Cunningham pentru detectarea celulelor care formează anticorpi, de asemenea. Prezintă o metodă directă pentru numărarea celulelor care sintetizează IgM. Metoda indirectă de determinare a celulelor producătoare de IgG, aceasta necesită adăugarea unui sistem reactiv antiglobulină. Diferența dintre numărul de zone obținute prin metode directe și indirecte corespunde numărului de celule care formează IgG. Metoda inversă permite tuturor celulelor producătoare de Ig, în legarea Ig secretate din eritrocite încărcate reactiv antiglobulină. Modificarea metodei hemolizei locale, care prevede utilizarea de panouri multi-godeu, se pot testa simultan mai multe eșantioane. b. Fotografie zonelor de hemoliză locale în câmp întunecat. Ei arata ca o zone întunecate rotunjite (dintre care unele sunt marcate cu săgeți). Diferențele în ceea ce cantitatea zonelor hemoliză se datorează diferențelor de afinitate a anticorpilor și rata lor de secreție. (Prin amabilitatea domnului C. Shapland, doamna R. Hutchings si Dr. D. Male.)

Fig. 7.2. Reprezentarea schematică a metodei „Elispot“ (numele vine din limba engleză. EL1SA) pentru numărarea celulelor care formează anticorpi. Imaginea arată partea a panoului, în care sondele de antigen adsorbit (tireoglobulinei). pete vizibile celule hibridom localizare sintetizare autoanticorpi la tiroglobulina corespunzătoare. Celulele au fost detectate folosind reactivul antiglobulină conjugat cu fosfatază alcalină (prin amabilitatea R. Hutchings). Cele doua gaura din stânga sus și de jos a făcut diferit (în creștere secvențial) numărul de celule hibridoma judecând după o creștere a numărului de spoturi în godeurile respective. Gaura inferioară din dreapta este de control. Acesta a fost adăugat la celule hibridoma specificitate diferită.

Această metodologie se aplică și pentru detectarea celulelor care formează un anticorp de subclase diferite au suficient antiser izotipspetsificheskuyu iepure. Metoda hemoliza locală poate fi utilizată pe scară mai largă, în cazul în care antigenul eritrocite încărcate, de exemplu, polizaharidic pneumococic sau cusute la suprafața eritrocitelor grupe haptenă.
Modificarea „Elispot“ este faptul că suspensia de celule ce formează un anticorp a fost incubat cu antigenul imobilizat pe placă. Anticorpii secretați local se leagă la antigen și după îndepărtarea celulelor detectate folosind anticorpi marcați cu peroxidază la IgG. Reacția de culoare a fost apoi realizată prin turnarea pe fundul substratului cup dizolvat în gel. Difuzia limitată a produsului de reacție colorat în gel conduce la apariția unor pete macroscopice care calculează cu ușurință (fig. 7.2).

sinteza proteinelor

La formarea anticorpului celula este metabolismul rapid al lanțurilor ușoare, sunt detectate în citoplasmă în exces ușoară. Multe controlul fuziune de celule de mielom este rupt, și pot exista producție excesivă de lanțuri ușoare, sau chiar o încetare completă a sintezei lanțurilor grele. punți disulfurice între lanțurile pot fi formate într-un moment în care lanțurile grele sunt îmbinate la ribozomi (fig. 7.3), dar secvența de formare a produselor intermediare depinde de natura imunoglobulinei. Utilizarea etichetării puls cu aminoacizi radioactivi determinat că fiecare lumină și lanț greu sunt sintetizate în ansamblu polipeptidă, pornind de la N-end, și nu sunt asamblate din peptide individuale. Mai mult decât atât, lungimea fiecărui ARNm lanț posibil pentru a sintetiza întreaga întregime polipeptidă. Aceste date confirmă punctul de vedere este acceptat faptul că fragmentele genetice care codifică regiunile variabile și constante ale imunoglobulinelor sunt grupate în cursul mRNA despicare in nucleul altul.
Existența despicare alternative poate explica coexpresia IgD de suprafață și IgM cu V-regiuni identice (Fig. 7.4) și sinteza de comutare în receptor IgM secretorie (Fig. 7.5) în celule producătoare de anticorpi.

Comutarea claselor de imunoglobulină de fuziune apar în celule individuale B

Cinetica sintezei de imunoglobuline aparținând diferitelor clase, diferite. În cazul în care antigenul este introdus pentru prima dată, există un răspuns așa-numitul primar. În primul rând pot fi găsite celule IgM-producătoare, numărul care descrește ulterior rapid. Sinteza IgG atinge un maxim după un interval de timp îndelungat. Este aproximativ aceeași ca și în timpul introducerii inițiale a cineticii antigen secundare ale IgM. Cu toate acestea, în acest caz, concentrația de IgG în ser crește rapid la valori mult mai mari, iar apoi scade relativ lent (Fig. 7.6).

Fig. 7.3. Sinteza lgG2a murin. Când sinteza este finalizată H lanțurile, lanțurile polipeptidice adiacente pot conecta în mod spontan regiunile lor constante. Se crede că separarea lanțurilor grele sintetizate pe ribozomi promovează lanțuri ușoare aderență pentru a forma o moleculă de L-H-H. Un compus cu al doilea lanț ușor duce la formarea unei întregi molecule de imunoglobulină L-H-H-L (la Askonas VA Williamson A. R. (1986). Biochem.J. 109, 637).
Secvența de formarea de punți disulfurice între lanțurile variază între diferite imunoglobuline și determinat de puterea relativă de obligațiuni, care poate fi evaluată prin sensibilitatea la un agent de reducere. După formarea receptorului de imunoglobulină de suprafață este încorporată prin secvențe hidrofobe în membrana reticulului endoplasmic.

Fig. 7.4. membrană de suprafață IgM- și IgG receptori sunt aceeași specificitate pot fi exprimate în aceeași celulă ca rezultat al splicing alternativ al transcriptului primar aranjate dificil. Pentru simplitate, secvența lider nu este afișată. Liniile ondulate reprezintă introni.

Fig. 7.5. Mecanismul de despicare furnizarea de comutare de sinteză asupra formei membranei secretată de IgM. La secvența secretată hidrofobă IgM codificata de exoni M-M-IgM și ancorează receptorul în membrană este tăiat (secvența lider nu este prezentat pentru simplitate).

Aproximativ același lucru cu IgA, adică Imunoglobulinele aceste clase asigura eliminarea rapidă a antigenului introdus-re.
Există dovezi că celulele individuale pot trece de la IgM la IgG producției. La câteva zile după imunizare cu celule anticorp flageli Salmonella care produc izolate sunt plasate în picături de lichid de cultură sintetizate bacterii imobilizând anticorpi ca IgM, IgG și simultan.

Fig. 7.6. Dinamica sinteza IgM și IgG în răspunsul umoral primar și secundar la un antigen.
Într-o altă hârtie se arată că introducerea antigenului în recipienti iradiate spline adaptively imunizați cu un număr relativ mic de celule limfoide, coloniile de celule apar simultan sintetiza anticorpi cu izotip diferit lant greu dar idiotip. Acesta din urmă indică faptul că fiecare colonie a apărut dintr-o singură celulă progenitoare ai cărui descendenți se pot sintetiza anticorpi din diferite clase.
anticorp Sinteza izotipurile aproape toate T-dependente: animalele private de celule T, multe clase de anticorpi semnificativ suprimata. De exemplu, la șoareci este adevărat pentru IgGI, IgA, IgE si IgM parțial. Creșterea răspunsului imun adjuvant Freund complet, care este o emulsie apă-în-ulei ce conține un antigen în fază apoasă și ucis bacili tuberculoși în faza uleioasă (p. 207), probabil, în parte datorită activării celulelor T helper, care stimulează sinteza anticorpilor la T antigene. dependente presupunerea Consequent că răspunsul la antigeni independent-T (de exemplu, polizaharidic pneumococic, p. 111) nu trebuie să fie amplificat adjuvant Freund, este confirmată în practică. Mai mult decât atât, așa cum sa menționat mai sus, aceste antigene induc predominant sinteza IgM la generarea unei memorii imunologice slab în același mod ca și dependente T-antigene introduse timectomizat animale nou-născuți, adică, Celulele T defavorizate.

Fig. 7.7. Comutarea izotipului anticorpilor sintetizați cu specificitate identică (în cazul IgM la IgG) are loc prin „tăierea buclă“. Acest proces implică secvență de comutare specială (cercuri roșii). Ca rezultat, porțiunile intermediare ale ADN-ului (# 956;, # 948; și # 947; 3) se pierd.

Astfel, cel puțin la rozătoare comutare sinteza asupra sintezei IgG IgM și alte clase de anticorpi are loc sub controlul celulelor T, care aparent sunt efectuate de factori solubili, cum ar fi # 947; factor de diferențiere a celulelor B (cu 116.). Secvența genei VDJ este transferată # 956; # 948; la o altă regiune constantă de gene, iar în acest proces, un rol important este jucat de „comutare site-uri“ (fig. 7.7). Ca urmare, anticorpii sunt formate din aceeași specificitate, ci a unui izotip diferit.