Tulpina de bacterii Acinetobacter calcoaceticus - producerea de endonuclează de restricție recunoaște și

Utilizare: microbiologie și biotehnologie. Esența invenției: producătoare de detectare a Acinetobacter tulpina calcoaceticus VKPM B-6337, și oferă o enzimă de restricție nepatogen recunoaște și scindează secvența de nucleotide 5 -GGTACC-3. cu randament ridicat și activitatea enzimei. enzimă Randamentul este de 60.000 unități / g biomasă umedă, activitatea specifică a enzimei țintă este de 10.000 - 100.000 U / ml. Enzimă de restricție Acc 651 este enzimă de restricție izoschizomer Kpn 1 și poate înlocui acesta din urmă, în toate lucrările de inginerie genetică. 1 il.

Invenția se referă la industria microbiologică și inginerie genetică și se referă la obținerea unei noi tulpini producătoare de endonucleaza situs specific capabil să recunoască și să cliveze o secvență de nucleotide 5'-GGTACC-3“.

Enzimă de restricție astfel de specificitate poate fi utilizată pentru a studia structura primară a ADN-ului, diferite de cartografiere fizică a genomilor. Acest endonucleazică este un model convenabil pentru studierea specificitatea interacțiunilor acide proteine ​​nucleic.

Cunoscut tulpina Acinetobacter calcoaceticus, producând enzimă de restricție Accl, AccII și AccIII (situsuri de recunoaștere a 5'-GTMKAC-3 '5'-CGCG-3' și 5'-TCCGGA-3', respectiv) [1] Un dezavantaj al acestei tulpini este într-o biomasă care sunt trei enzimă de restricție. Aceasta complică procedura de purificare, și nici unul din enzima de restricție nu este capabil să recunoască și secvența nucleotidică scindează 5'-GGTACC-3“.

tulpina cunoscută Achromobacter species718, producând endonuclează de restricție recunoaște și scindează secvența de nucleotide 5'-GGTACC-3 „[2] Dezavantajele acestei tulpini este durata mare de cultivare (10 h), randamentul de biomasă a fost de 0,2 g / l. Odată cu distrugerea biomasei folosite echipamente speciale (presa franceză).

Cel mai apropiat stadiu anterior tulpina revendicată este o tulpină de Klebsiella pneumoniae, care produce enzima de restricție Kpn I [3] Această tulpină produce un endonuclează de restricție recunoaște și scindează secvența de nucleotide 5'-GGTACC-3“. enzimă Randamentul este de 50000 unități / g biomasă umedă.

Principalul dezavantaj al acestei tulpini este patogenitatea. Microbul este un locuitor al membranelor mucoase ale tractului respirator. Aceasta provoaca pneumonie, procese supurative, cistita. La primirea biomasei este necesar să se respecte reguli speciale de siguranță.

Un obiectiv al invenției este de a obține o tulpină care produce restricția enzimatică recunoaște și scindează secvența de nucleotide 5'-GGTACC-3“, cu un randament ridicat de enzime care nu necesită condiții speciale pentru a se obține o biomasă, un non-patogene pentru om.

Scopul este atins prin identificarea și utilizarea unei tulpini de Acinetobacter calcoaceticus producătoare de situs specific al enzimei de restricție Acc65 I.

Tulpina izolată de către producătorii de căutare de endonucleaze de restricție.

Tulpina rezultată este Acinetobacter calcoaceticus nonpathogenic și depus la Institutul de Genetica de Cercetare VKPM sub numărul de B-6337, produs și le-a numit enzima de restricție Acc65 I conform nomenclaturii comune.

Tulpina de Acinetobacter calcoaceticus se caracterizează prin următoarele caracteristici.

Celulele tija de formă, drepte și groase (1,0-1,5 x 1,5-2,5 um), în faza de creștere logaritmică și aproape coccal într-un spital. În mod avantajos, uneori, în perechi, în lanțurile. Nu formează endospori și flageli. Colorația Gram Gram-negativ.

Tulpina nu este pretențios la factorii de creștere, se dezvoltă bine pe medii nutritive obișnuite (SPA, MPA, MPB). Pe o agar formele medii colonii mici, rotunde, nepigmentate lucioase, cu o margine netedă.

Temperatura optimă de creștere de 30 ° C, pH 7,0-7,2.

Reseeding cultură a fost menținut pe mediu solid, este stocată într-o soluție de glicerol la 70 ° C sau stare uscată prin congelare.

Negativ în reacția Voges-Proskauer; indol și nu formează H2 S; katalazopolozhitelen; oksidazootritsatelen. Forme un acid de glucoză nu a fost observată o creștere anaerobă în agar; rezistent la penicilină.

Pentru cultivarea Acinetobacter calcoaceticus mediu din următoarea compoziție utilizată, g / l Peptonă 10; extract de drojdie 5; glucoză 5; restul de apă distilată. Cultivarea a fost realizată la 30 ° C și aerare intensivă pentru a realiza o încetinire fază de creștere.

Randamentul de 60.000 unități de enzimă / g biomasă umedă cu o activitate specifică 10.000-100.000 U / ml.

Determinarea diferențelor dintre tulpina propusă pe tulpina prototipului sunt: ​​non-patogene, productivitatea ridicată a tulpinii; activitate ridicată a enzimei; Deoarece tulpina propusă se obține mai întâi și pentru a evidenția enzima de restricție având situsul de recunoaștere a 5'-GGTACC-3“, nu a fost folosit, este posibil să se concluzioneze că tulpina conform prezentei invenții, criteriile«noutate»și«nivel inventiv».

Desenul este un ADN produșii de hidroliză electroforetograma enzimă fag lambda Acc65I (dor.1), Acc65I și Kpnl (dor.2), Kpnl (dor.3).

Identitatea benzilor de clivaj în izoshizometriyu paralel și co-hidroliză le confirmă.

EXEMPLE EXEMPLUL 1 Prepararea biomasei și recuperarea enzimei.

Înainte de a începe producerea de celule tulpina passaged buclă bacteriologic pe mediu agar. Cutia Petri a fost plasat într-un termostat la 30 ° C După 10-12 ore de incubare celulele crescute trecute in in baloane cu mediu de creștere proaspăt constând din (g / l), peptonă 10, extract de drojdie (Difco) 5, 5 glucoză, rest apă distilată . Cultivarea a fost efectuat la 30 ° C cu aerare de 1,5 volum / min, sub agitare la 250 rot / min, pentru a crește faza de decelerare (3-5 ore). Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 1500g, la o temperatură de 1 ° C dezintegrare, separarea și purificarea au fost efectuate în conformitate cu procedura de Bickle, Pirotta, Imber [4] Exemplu Exemplul 2 Determinarea activității și enzimă specificitate.

Specificitatea enzimei este determinată de modelul de ADN substrat paralel și co-hidrolizează. Identitatea hidrolizei tablourilor pe 1-3 piste sugereaza ca aceste enzime să recunoască și să cliveze aceeași secvență de nucleotide 5'-GGTACC-3“.

Enzyme Randament Acc65I determinat prin hidroliza imagine electroforetică a ADN fagul lambda. O unitate de activitate este definită cantitate minimă de enzimă necesară pentru digestia completă 1 ug ADN fagic lambda timp de 1 oră la 37 ° C Randamentul enzimei este de 60.000 unități / g biomasă umedă, activitatea specifică de 100.000 unități / ml.

Enzima a fost depozitată la 20 ° C în glicerină.

Astfel, tulpina obținută, are următoarele avantaje față de cunoscute: tulpina nepatogene, productivitate ridicată;
activitate ridicată a enzimei;
Deoarece enzima de restricție Acc65 I are site-ul de recunoaștere a 5'-GGTACC-3“, este identic cu un situs de recunoaștere a enzimei de restricție Kpnl, acesta poate fi înlocuit în toate prototip inginerie genetic lucrări.

Bacteriile Acinetobacter tulpina calcoaceticus VKPM B-6337 care produc endonuclează de restricție recunoaște și scindează secvența de nucleotide 5 -GGTACC-3.