Transcriptaza inversă - studopediya

Cand au studiat retrovirusuri, genomul care conține molecule monocatenare ARN, sa constatat că în proces, exact etapa de dezvoltare intracelulară ei trec integral-talkie genomul său sub formă de ADN dublu catenar in cromozomi ai celulei gazdă. In 1964 g. X. Temin ipoteza existenței virusspetsifichnogo enzimă capabilă sin tezirovat ARN complementar cu matricea ADN-ului. In 1970 g. X. Temin și Mizutani S. și indiferent D. Baltimore lor au descoperit o astfel de enzimă în prepararea virionilor extracelulare ale virusului sarcomului Rous. Acest ADN polimerază ARN-dependentă numită revers transcriptazei (revers transcriptaza).

Studiul cel mai detaliat al revers transcriptazei păsări PET rovirusov. Fiecare virion conține un ochi-lo 50 molecule ale acestei enzime. Revers transcriptaza este compusă din două subunități - # 940; (65 kDa) și # 946; (95 kDa) prezentă în cantități echimolare. # 940; Subunitate pre-resents o parte N-terminală (două treimi) # 946; subunitate.

Revers transcriptaza are o margine pe ea-puțin trei enzimatice aktivnos-tyami:

· O polimerază ADN folosind onorurilor ka-matrice atât ARN și ADN-ului;

· Activitatea RNazei H hidrolizeaza ARN în hibrid ARN-ADN, dar ARN nu simplu sau dublu catenar;

Primele două activități sunt necesare pentru sin-teză a ADN-ului viral și endonucleazică, aparent, este important pentru integrarea ADN-ului viral în celulele gazdă evaluat-n. # 946; revers transcriptaza subunitate posedă toate cele trei activități, în timp ce # 940; subunitatea - numai polimerază și RNaza H.

Purificată revers transcriptaza sin-ADN ziruet ambele ARN și ADN-mat-ritsah. Pentru a începe sinteza, revers transcriptaza, precum și alte polimeraze, avea nevoie de un scurt complot dublu catenară - primer. Grundul poate fi segment mono-catenar atât ARN și ADN, procedeu rea-TION sunt legați covalent la catena ADN nou produs.

Reverstranscriptazei este de preferință utilizat pentru transcripția ARN mesager într-un ADN complementar (ADNc). Transcrierea inversă ob reacția este efectuată în prezența unor inhibitori puternici ai activității de RN-ază. Astfel, este posibil să se obțină în lungime completă copie ADN a moleculelor țintă ARN. Ca amorsa cu transcrierea inversă a poli (A) -conținând ARNm folosind oligo (dT) (Fig.) Și pentru moleculele de ARN care nu au un (A) terminus de fierbere-3'-poli - sinteza chimică Rowan oligonukleotndy complementare capătul 3“al ARN-ului în studiu. În plus, ultima-rice tip de molecule de ARN poate fi transformata in poli (A) -conținând folosind poli (A) polimerază E. coli.

După sinteza ADN-ului cu lanț complementar ARNm și distrugerea ARN (de obicei prima nyayut alcalină tratament) este efectuat-sin mes a doua catenă de ADN. Astfel, capacitatea de a folosi revers transcriptaza, pentru a forma o 3'-con Zach cADN știfturi samokomplementar-VASTE monocatenare care pot îndeplini funcția de primer-TION. Șablonul servește ca prima bandă cADN. Această reacție poate fi catalizată de ambele revers transcriptazei și ADN-polimerazei I E. co-li. Combinația acestor două enzime crește randamentul de molecule dublu catenare cu drepturi depline ADNc.

La finalizarea sintezei primei și a doua bandă cADN rămâne în buclă în ac de păr legat covalent, care a servit ca primer în sinteza catenei a doua. Această buclă este clivat de S1 endonuclease, distrugând în mod specific siturile monocatenare acizilor nucleici. On-razuyuschiesya capetele nu ies întotdeauna la vayutsya-blunt și reparat Blunt cu fragmentul Klenow al ADN-polimerazei I de E. coli, pentru a spori eficiența-nului donarea ulterioară. ADNc rezultat dvuhtse-rinichi poate încorpora apoi în vectori-nating clo propagate în parte molecule ADN Ridnyi Gib și utilizate pentru studii ulterioare.