Tema 3 metode de cercetare microscopice

Identificarea estimată a microorganismelor dintr-un eșantion.

Studiind anumite caracteristici și structuri de microorganisme (de exemplu, capsule, flageli și t. D.) morfologice.

Studiul frotiurilor colorate de colonii și culturi pure.

Până în prezent, cel mai frecvent utilizat este o microscopie cu lumină.

microscopie cu lumină oferă crescut până la 2-3 mii de ori, de culoare și imagini în mișcare a unei ființe vie, microcinematography posibilitate și observarea îndelungată a aceluiași obiect, să evalueze dinamica și chimia. O imagine de microscop cu lumină se formează datorită faptului că un obiect și diferitele sale structuri absorb selectiv lumina de diferite lungimi de undă (contrast de absorbție) sau din cauza schimbării luminii fazei de undă atunci când lumina trece prin obiect (contrast de fază).

Principalele caracteristici sunt orice microscop putere de rezoluție și contrast. Rezoluție - distanța minimă la care două puncte sunt expuse separat prin microscop. Rezoluția ochiului uman în cel mai bun mod de viziune este de 0,2 mm. contrastul imaginii - diferența de luminozitate și imagine de fundal. Dacă această diferență este mai mică de 3-4%, este imposibil de a prinde orice ochi sau o placă fotografică; atunci imaginea va rămâne invizibil chiar și atunci când microscopul rezolvă detaliile. Contrastul afectează proprietățile obiectului, schimbarea ieșirii de lumină față de fundal, și capacitatea de a captura optica apar diferențe în proprietățile fasciculului. Posibilitatea unui microscop cu lumină este limitată de natura de undă a luminii. Proprietățile fizice ale luminii - culoare (lungime de undă), luminozitatea (amplitudinea undei) faza, densitatea și direcția de propagare a undei sunt schimbate în funcție de proprietățile obiectului. Aceste diferențe și sunt utilizate în microscoape moderne pentru a crea un contrast.

Grosisment unui microscop este definit ca un produs de lentile mai mari pe mărire a ocularului. In cercetarea tipic microscop ocular mărire este de 10, iar creșterea lentile - 10, 40 și 100. Prin urmare, creșterea microscopului este de la 100 la 1 000. Unele microscoape au un nivel crescut la 2 000. O mărire mai mare este lipsită de sens, deoarece în care rezoluția nu este îmbunătățită. În contrast, calitatea imaginii se deteriorează.

Apertura numerică este utilizată pentru a exprima rezoluția sistemului optic. Apertura numerică - este o optică „acoperire“ a cristalinului, este o măsură a cantității de lumină care intră în obiectiv. Diafragma numerică a obiectivului este indicată pe jantă. Diafragma condensatorului trebuie să se potrivească cu deschiderea numerică a cristalinului. Orice obiectiv cu diafragma numerică, se invecineaza cu aer (adică „sistem uscat“), nu poate depăși 1, deoarece indicele de refracție al aerului este 1. Deschiderea numerică poate fi îmbunătățită prin creșterea indicelui de refracție al mediului între lentila obiectivului frontal și glisant, aducându-l la indicele de refracție de sticlă (1.5). În acest scop, între lentila obiectivului frontal și obiectul investigat este plasată o picătură de lichid, cu un indice de refracție mai mare decât indicele de refracție al aerului, de exemplu, o picătură de apă (n = 1,3), glicerol (n = 1,4) sau cedru (imersie) ulei (n = 1,5). Pentru fiecare dintre lichidele de mai sus a produs lentile speciale numite imersiune.

microscopie optică include microscopie de transmisie conventionala (camp deschis, închis), contrast de fază, fluorescent. Recent, a dezvoltat alte metode de microscoape si microscopie - inversiune ikonfokalnaya microscopia de scanare cu laser.

microscopie în câmp luminos face posibilă explorarea obiectelor în lumină transmisă camp luminos. Acest tip de microscopie pentru studii de morfologie, dimensiunea celulei, pozițiile lor relative, organizarea structurală a celulelor și alte caracteristici. La microscop rezoluția maximă de 0,2 microni, care oferă microscop foarte precise mărire la 1500H.

microscopie de contrast de fază vă permite să observe mai clar vii obiecte transparente, care au indici de refracție apropiați de indicii de refracție ai mediului. Acțiunea microscop cu contrast de fază se bazează pe interferența luminii în planul imaginii cauzată de o schimbare de fază (folosind inelele de fază în apertura diafragmă). Când microscopia cu contrast de fază se utilizează adesea microscoape biologice cu un aranjament invers de optică - inversat microscoape. Astfel de microscoape, lentilele sunt aranjate din partea de jos, și condensator - top.

Prin utilizarea contrast de faza studiu de microscopie forma, mărimea, poziția relativă a celulelor, mobilitatea acestora, reproducerea, germinarea sporilor de microorganisme, și așa mai departe. D. Prin utilizarea acestei metode de contrast microscopie de viață, microorganisme necolorate crește dramatic și apar întunecat pe un fundal luminos (contrast de fază pozitivă ) sau lumina pe un fundal întunecat (contrast de fază negativă).

microscopie Darkfield se bazează pe iluminarea obiectului razele oblice ale luminii. În aceste raze de lumină nu intră în obiectivul, astfel încât câmpul de vedere apare întunecat. Un astfel de preparat se realizează prin utilizarea specială condensator de iluminat darkfield. Darkfield microscopie este o metodă foarte simplă, dar eficientă și este foarte potrivit pentru imagistica de viață și specimene biologice necolorate. Având în vedere ușurința de instalare, calitatea imaginilor este foarte bun.

Atunci când microscopie într-un câmp întunecat, puteți vedea obiecte a căror valoare este măsurată în sutimi de micrometri, care este dincolo de puterea de rezoluție a microscopului convenționale câmp luminos. Cu toate acestea, observarea obiectelor în câmp întunecat permite să investigheze doar contururile celulelor și nu oferă posibilitatea de a revizui structura lor internă.

Fluorescent (fluorescenta) microscopie se bazează pe capacitatea unui număr de substanțe de origine biologică sau anumiți coloranți strălucire atunci când sunt iluminate cu raze ultraviolete invizibile sau lumină albastră. La utilizarea luminii ultraviolete microscop putere de rezoluție poate fi de până la 0,1 microni.

Celulele de microorganisme tratate cu coloranți speciali - fluorocromatici (orange acridină, primulin, rodamina, etc.), ca o foarte dilueze soluții apoase de 1: 500-1: 100 000. Astfel de soluții sunt slab toxice, ceea ce face posibil studiul celulei intacte. În funcție de compoziția chimică, structura celulară în diverse grade și pot absorbi coloranți luminesce la mod diferit. În plus, fluorocromi adsorbit celulele moarte de viață inegal și. Acest lucru permite utilizarea acestui tip de microscopie pentru studii citologice și imunologice, determinarea viabilității celulare și t. D.

Microscopia electronică poate detecta obiectele care nu sunt permise atunci când se utilizează razele de lumină sau ultraviolete. Teoretic razreshenieprosvechivayuschego microscop electronic este de 0.002 nm; rezoluția efectivă a microscoape electronice moderne este aproape de 0,1 nm. În practică, rezoluția pentru obiectele biologice de până la 2 nm.

Scurta lungimea de unda a electronilor permite să se distingă obiecte în dimensiunea 0,5-1,0 nm. În microscoapele electronice moderne de pe ecran a realizat o creștere a 5000- 200 000. Cu o astfel de rezoluție mare, este posibil să se identifice părți componente ale structurilor bacteriene. De exemplu, folosind depunerea de săruri ale metalelor grele din jurul bacteriilor și pătrunde în neregularităților de suprafață se obține datorită opacifierii diferențiale electroni întârziere. Acest efect este numit de contrast negativ.

Microscop electronic în care o imagine este formată prin trecerea (radiografie) electroni prin specimen, este numit un translucid (sau unelte).

microscopie SEM (electronică de baleiaj (SEM), fascicul de electroni scanează rapid suprafața probei, cauzând radiație care formează o imagine pe un ecran luminos. Pentru REM este caracterizat prin rezoluție mare, gama largă de mărire (până la 100 000 și de mai sus), o mare adâncime de focalizare (

100 microni), o varietate de moduri de operare. Scanarea microscop oferă o imagine a suprafețelor și permite să se obțină o imagine tridimensională.

Laser microscopie confocala face posibilă obținerea unei imagini clare și a vedea obiecte în focalizare pe toată suprafața. Această metodă este adecvată numai pentru studiul obiectelor auto-luminos (fluorescente). Atunci când sunt combinate cu tehnologia de calcul reconstrucția spațială disponibilă a obiectului studiat. In imagini de microscopie de scanare cu laser confocal secțiunilor transversale interioare sunt formate prin scanarea unui fascicul laser focalizat pe diferite (405, 488, 532, 635 nm) cu laser și filtrarea spațială a radiației. Când se utilizează un microscop câmp apropiat de scanare (SMBP), o putere de rezoluție ridicată. Cea mai mică dimensiune a elementului obținut prin SMBP este de 20 nm la o lungime de undă de 0,486 nm lumină. În elementul de imagine controlată nu produce efecte de difracție sau interferențe care împiedică stabilirea frontierelor sale. SMBP trăsătură distinctivă în comparație cu forța microscop atomic este sensibilitatea la caracteristicile optice ale suprafeței eșantionului de testat, lungimea de undă a luminii, luminescența și altele.

Microscopia interferență calculator face posibilă obținerea de imagini cu contrast ridicat sub supravegherea structurilor subcelulare; în multe cazuri, folosite pentru a studia celulele vii. Principiul de funcționare al microscopului interferență automatizată bazată pe interferența razelor laser de lumină reflectată de oglinda de referință și oglinda în care este plasat obiectul de fază măsurat. Teoretic, rezoluția maximă realizabilă poate media de 0,2 nm, practic, este de 0,4 microni.

X-ray tomografie computerizata (CT), tomografie cu emisie de pozitroni (PET) permite observarea obiectelor în condiții normale.