Echipament histologie

Principiile de bază de preparare a formulărilor pentru microscopie optică și electronică, materialul de captare (biopsie, o biopsie pumn ac, autopsie). facilități de fixare, deshidratare, compactare, pregătirea de tăieturi pe microtom și ultramicrotom. Tipuri de mipreparatov - felie, frotiu, de imprimare, de film, măcinare. Agenți de colorare și contrastante. Conceptul colorantului histologică.

Conceptul de metode histochimie, autoradiografie de viață. Utilizarea imunocitochimie pentru exprimarea identificare si molecula de vizualizare în celule, țesuturi și organe. Metode cantitative de cercetare.

1. Metode de examinare histologică.

2. Principiile de bază și etapele de preparare a preparatelor histologice.

Metodele utilizate pentru examinarea histologică:

I Intravital metoda de

Studiile Intravital au ca scop este de a obține informații cu privire la activitatea celulară: mișcare, diviziune, creștere, diferențiere, interacțiune celulară, durata de viață, distrugere, schimbări reactive sub influența diferiților factori.

Studiul celulelor și țesuturilor vii în afara corpului este posibil (in vitro) sau într-un organism (in vivo).

Un studiu de celule și țesuturi în cultură vii (in vitro) -

Distinge: a) culturi în suspensie (celule suspendate în mediu de cultură), b) țesut, c) organe, g) monostrat.

țesut metoda de cultură în afara corpului este cea mai comună. țesut Cultured pot fi transparente în camere speciale, închise ermetic. În condiții sterile a camerei este plasată o picătură de mediu de cultură. Cel mai bun mediu de crestere este plasma de sânge, la care sa adăugat extract embrionar (extract din țesuturi de embrioni care conțin un număr mare de substanțe care promovează creșterea). La aceasta a fost plasată o bucată de țesut sau organ (nu mai mult de 1 mm3) pentru a fi cultivate.

Rezista țesutul de cultură trebuie să fie la temperatura corpului a corpului, tesutul este luat pentru testare. Deoarece mediul de creștere devine repede inutilizabil (acumulând produse de descompunere emiși tesut cultivate), apoi la fiecare 3-5 zile, este necesar să se schimbe.

Folosind metoda de cultivare a relevat mai multe modele de diferențiere, de transformare a celulelor maligne, interacțiuni între celule în sine, precum și virusuri și microbi. Cultivarea de țesuturi embrionare ne-a permis să studieze dezvoltarea oaselor, cartilajelor, pielii și altele.

De o importanță deosebită este metoda de cultivare pentru observații experimentale în celule și țesuturi umane, în special, pentru a determina sexul, transformare malignă, boli genetice și altele.

1. Principalul dezavantaj al acestei metode este că țesutul sau organul este studiat în mod izolat de corp. Fără a se confrunta cu o influență neuroumoral corpului, acesta își pierde diferențierea inerentă.

2. Necesitatea de frecvente directe (cultivare în timpul prelungit).

3. Aceleași țesuturi ale factorului de refracție.

B. In studiul in vivo a celulelor într-un organism (in vivo)

1. Observarea structurilor din organismele vii. Exemplu: folosind o microscopie electronică de transmisie specială, ferestrele pot fi văzute circulația sângelui în microvessels.

2.Metod implantare camere transparente în corpul animalului. Obiectul testat este plasat într-o cameră transparentă (echipată cu microgolurilor pentru metabolism) și implantat, de obicei, în auriculul unui animal experimental. Folosind un microscop se poate observa dinamica modificărilor celulelor și țesuturilor pentru o lungă perioadă de timp.

3.Metod folosind camere naturale transparente ale unui animal experimental, de exemplu, camera anterioară situată între cornee și iris. Această metodă a fost utilizată pentru a studia stadiile timpurii ale dezvoltării embrionului și a endometrului și ciclic schimbă al.

4. Metoda de transplant - este utilizat pe scară largă pentru a studia hematopoieza. celule din sânge și măduvă osoasă de la animale sănătoase transplantate animale au fost supuse la radiații letale. animale experimentale supraviețuiesc datorită grefării celulelor donoare care formează colonii hematopoietice în celulele splinei (formatoare de colonii metoda). Această metodă a fost stabilită pentru dezvoltarea surselor tuturor celulelor sanguine.

Deoarece țesuturile din corp au aproximativ același coeficient de refracție, uneori, în scopul diferențierii acestora a recurs la utilizarea coloranților pe parcursul vieții.

Prin vopsele intravital includ albastru de metilen albastru tripan, roșu Congo.

coloranți Durata de viață trebuie să îndeplinească următoarele cerințe:

1. Să fie inofensiv pentru organism.

2. excretat rapid din organism.

Colorarea obiectelor vii are două varietăți:

1. Vital (colorație intravitală) - colorant injectat în animalul în care se leagă selectiv de celule specifice, organite, substanța intercelulară ... De exemplu, litiu trypan albastru sau carmin identifica fagocite; Alizarină - nou format matricea osoasă.

2. pictura supravital - colorarea celulelor vii izolate din organism. În acest fel, erezii Brilliant colorant albastru dezvăluit tinere celule roșii sanguine (reticulocite), Janus verde - mitocondrii, neutre rosu - lizozomi.

METODE DE postmortem II

Obiectul principal al studiului este metoda de preparare histologice post-mortem. Medicamentul poate fi:

- accident vascular cerebral (sânge, măduvă osoasă, salivă ...)

- print (splina, ficatul, timus, ...)

- de film (peritoneu, pleura, Pial ...)

- măcinare (dinți, oase ...)

Cele mai frecvent utilizate secțiuni colorate subțiri delimitate de Balsamul - așa-numitul preparatul histologic permanent.

Prepararea preparatului histologic permanent

Principalele etape ale preparării preparatelor histologice sunt după cum urmează:

1. Material Capture.

5. Încorporarea în mediul de etanșare.

6. Prepararea felii.

7. secțiuni colorate.

8. Deshidratarea, albire și felie concluzie în balsamic canadian de brad sau pentru depozitarea pe termen lung.

1. Material Captură pentru prepararea medicamentului din organism viu (biopsie), sau de la un cadavru (autopsie). Subiectul nu trebuie să depășească 1 cm3.

2. Fixarea produsului obiect pentru a menține structura țesutului sau organului, și prevenirea sigiliului parțială de deteriorare. Având în vedere cele de mai sus, titularii trebuie să îndeplinească următoarele cerințe:

a) nu trebuie să modifice structura obiectului,

b) necesitatea de a se rostogolească proteine

c) să fie bactericid.

Catchers distinge simple și complexe.

Kprostym includ monocomponent: formalină (soluție de formaldehidă în apă), alcool, clorură mercurică și altele.

Prin opritoarele provocatoare includ cleme, constând din mai multe componente. De exemplu: 1. amestec Zenker-formolovaya (sublimeze, formol, bicromat de potasiu, apă, sulfat de sodiu). Fiecare componentă a acestui amestec îmbunătățește calitatea celuilalt. De exemplu: clorură mercurică este un sistem de blocare foarte bun, dar slab pătrunde materialul; dicromat de potasiu, în schimb, un zăvor slab, dar bine impregnează materialul. Împreună, ele se completează reciproc. 2. Lichid Carnoy (alcool, formaldehidă, acid acetic glacial). stabilirea timpului depinde de tipul de reținere, tipul și mărimea obiectului și scopurile urmărite de către cercetător. Aceasta variază de la câteva minute la câteva zile și chiar luni.

3. spălat se face în scopul scutirii de la dispozitivul de reținere. Produce-l în apă curentă (până la 1 zi).

4. Deshidratarea este efectuată în alcooli fortăreței în creștere (60 la 100 de grade), pentru a preveni tesutul de contractie rapida. 100 de grade se numește un alcool absolut. concentrația de alcool absolut se realizează prin adăugarea la Desiccants 96 de alcool: sulfatul de cupru calcinat sau oxid de calciu.

5. Încorporarea în mediul de etanșare. După închiderea deshidratarea produsului a obiectului în mediul de etanșare. Astfel de medii sunt parafina celloidin.

Încastrarea în parafină. Parafina - un solid - Adipocere.

Pre obiect de etanol absolut a fost transferat într-un amestec de alcool și solvenți lipidici (xilen, cloroform), la un raport de 1: 1 și apoi o porțiune din solvenții lipidici puri. Apoi, obiectul este plasat într-o soluție saturată în solvenți lipidici de parafină, cu o temperatură de topire de 37 de grade, menționate la masa practica snegopodobnoy histologică. În această soluție, obiectul trebuie să fie păstrate la o zi. Apoi, obiectul pentru câteva ore transferate succesiv în 2 porții de parafină pură, care are o temperatură de topire de 54-56 grade (într-un cuptor). După ce obiectul este suficient impregnat cu parafină, blocul de parafină format prin turnare a obiectului porțiune parafină netă în forme speciale, urmată de răcire rapidă.

a) turnarea ceara permite obținerea secțiuni subțiri uniforme (2-7 microni);

b) turnarea ceara face posibilă obținerea unei serii de reduceri, care este necesară pentru stratificarea un obiect de studiu.

6. Prepararea feliilor pentru a produce dispozitive speciale - Microtoame. Microtoame se disting: a) toboganul

b) de cusut (rotative).

Blocul Sannomiya microtomul mai puternic încă în cuțit obektoderzhatele și microtomul, trecând peste ea, făcând tăieturi. Microtom are un șurub micrometric conectat la obektoderzhatelem. Fiecare rotație șurub determină o mișcare ascendentă obektoderzhatelya corespunzând obiectului cu o distanță predeterminată (grosimea slice predeterminată).

De cusut contrar microtomul, cuțit microtomul montate fix, și cu obektoderzhatel obiect deplasabil.

Secțiunile de parafină rezultate au fost lipite pe o lamelă de sticlă folosind ou încălzire alb sau pentru o lampă spirit sau într-un cuptor.

7. secțiuni colorate. Colorarea felii se efectuează pentru a mări contrastul structurilor. Pentru a face acest lucru, trebuie să deparafinizate secțiuni: elimina ceara prin scufundare slide-uri în xilen, și apoi a scăpa de clătire secventiala xilen în alcool și apă.

Vopseaua de forfecare aplicată timp de câteva minute, apoi se spală cu apă. Frecvent utilizate de colorare combinate folosind doi sau mai mulți coloranți, coloranți selectiv diferite structuri, cum ar fi hematoxilină (miez) + eozina (citoplasmatică).

obiect 8. Concluzie pentru depozitarea pe termen lung.

După colorare, secțiunile au fost spălate cu apă, deshidratat cu alcool, alcoolul a fost îndepărtat cu xilen, ceea ce face, de asemenea, secțiunile transparente. Apoi, secțiunile au fost aplicate fie picătură canadian ulei de brad, după care este acoperit cu un capac de sticlă și dezumidificat. Astfel de preparate histologice constante pot fi stocate pentru o lungă perioadă de timp.

Caracteristici de gătit secțiuni congelate

umplere histologică normal dureaza aproximativ 7 zile, dar în unele cazuri, necesită un diagnostic rapid, imediată a medicamentului (CITO!). În astfel de cazuri, o metodă de congelare. Convulsii, dar țesutul nefixate înghețat în camere speciale - criostat. Folosind bloc de gheață de apă formată (parafină analog). Camera este montat Microtom criostat, prin care au fost făcute secțiuni înghețate. La temperatura camerei, ele sunt dezghețate și adecvate pentru colorarea histologică imediată. Această metodă permite evaluarea structurii medicamentului în câteva minute - la o oră. Cu toate acestea, metoda are un dezavantaj major: în procesul de congelare în cristale de gheață de țesut format de rupere structura intravital (structura sau distorsiune a imaginii se numește - artefact).

Are un material de electroni de studiu microscopic

În special datorită studiilor de nivel submicroscopic si moleculare. cleme convenționale cauza proteinelor de coagulare brute care electroni nivel microscopic (EM) ar determina apariția de artefacte. Prin urmare, în utilizarea glutaraldehidă oarba EM sau tetroxid de osmiu - provocând un strat subțire de proteine, coagulare moi. Rășina epoxidică este utilizată ca mediu de condensare. Pregătirea secțiunilor ultrasubtiri (nm) produse pe dispozitive speciale ultramicrotom cu cuțite de sticlă sau de diamant.

Există mai multe clasificări ale coloranți. Prin coloranți de origine sunt vegetale, animale și minerale. Proprietăți chimice - acide, bazice, neutre. Cele mai mari Coloranții de clasificare importanță practică pentru alte scopuri. Conform acestei clasificări, toate vopselele sunt împărțite în două grupe:

Intravital I (a se vedea. Mai sus)

coloranți postume sunt împărțite în 2 tipuri: 1. Generalități

1. Obschiekrasiteli la rândul lor sunt împărțite într-o) nucleară (de bază)