Pregătirea secțiunilor de blocuri de parafină - baza histologiei

Pagina 42 din 68

Bare prelucrate la un bloc de parafină din lemn este fixat ferm în microtom clemă plasând axa lungă paralelă dlinniku microtom. Apoi, prin setarea unghiului de tăiere dorită și unghiul corect de înclinare a cuțitului, este borne cu șurub ferm fixe și este poziționat deasupra unității.

Figura 74.
Tăierea blocuri de parafină Tehnica.

După aceea, unitatea de alimentare cu șurub de reglare este setat astfel încât planul său superior a fost într-o poziție orizontală și nu a atins lama de cuțit 0.5-1 mm. Când se potrivesc preliminar la blocul de cuțit este terminat este setat la scară micrometrică, pentru o grosime (25-30 microni) secțiuni și mișcarea sanie cuțit începe unitatea de distribuție în sus cu ea până la primele secțiuni complet. Apoi produc bloc de simulare: se taie cu un exces de parafină scalpel, lăsând exprimate în jurul stratului de obiect nu este mai mare de 3,2 mm, și atașați unitatea de formă dreptunghiulară. Ulterior scală micrometric ajustată la grosimea slice dorită și trece la materialul de tăiere final.
Trebuie amintit faptul că mișcarea împingătorului cuțit de-a lungul pistei trebuie să fie făcut fără probleme și fără efort exagerat. Este imposibil să apăsați în jos pe partea de sus a mânerului, deoarece aceasta duce la o deplasare a stratului de ulei situat între suprafețele de alunecare, și coborârea lama, iar sectiunile nu sunt netede. circulație cuțit Microtom în momentul trecerii unității trebuie să fie efectuate rapid.
Studiind tehnicieni mai bine să se înceapă cu pregătirea secțiunilor histologice 14-16 microni și numai treptat, ca dezvoltarea tehnologiei de tăiere, reduce grosimea felii.
încărcat corect bucăți mici de organe și țesuturi la o temperatură optimă în cameră este modul bun tăiat și tăiat, de obicei, cade pe cuțitul în stare îndreptată (unghiul de tăiere dreaptă). La tăierea blocuri mari de material solid și de multe ori secțiuni
poftă de mâncare. Cu toate acestea, acest lucru poate fi evitat prin lipirea și ridicarea periei tăiat pentru tăierea marginii în procesul de tăiere (fig. 74). Trebuie să vă asigurați că reducerea nu a fost fixat la lama, deoarece aceasta este aderența și deteriorarea acesteia. felie Gata îndepărtate cu grijă cu o lamă de perie umedă (în direcția dinspre partea din spate a lamei) și transferate fie la un diapozitiv preparat sau o ceașcă de apă caldă (35-40 ° C) distilat. Apa preîncălzită pentru a preveni apariția pe secțiunile suprafeței inferioare de bule de aer (care poate fi dizolvat în apă), împiedicând o lipire uniformă a secțiunilor de sticlă. Secțiunile au fost plasate pe apă este necesară (microscop slide) de suprafață, este atașat la un cuțit, care poate determina luciul caracteristic (partea superioară întotdeauna mată).

Fig. 75.
Ordinea secțiunilor seriale pe sticla.
La tăierea, este necesar să se asigure că firele de păr ale pensulei nu sunt supuse la marginea de taiere a cutitului, deoarece acest lucru va deteriora lama.
Pentru o serie de studii necesare pentru a obține secțiuni în serie. Este important să nu se confunde secvența secțiunilor seriale aderate la un diapozitiv. În acest scop, banda este tăiată cu un bisturiu felii în bucăți individuale de aproximativ 3/4 din lungimea culisei și stiva este întotdeauna într-o anumită ordine de-a lungul sau peste sticla (fig. 75). Într-un număr diferit de felii (25-30 la 2 la 4), pot fi cazați în funcție de mărimea obiectului și mărimea diapozitivul pe un pahar.

Posibile erori în fabricarea secțiuni de parafină

În scopul de a obține un bun secțiuni histologice, trebuie să fie în măsură să identifice în timp util și de a elimina cauza, degradează calitatea de reduceri.

1. Slice crumbles. Motive: 1) parafină solidă; 2) temperatura ambiantă scăzută; 3) răcirea lentă turnarea de ceară; 4) un unghi mare de înclinare a cuțitului. Soluție: 1) Material perezalit parafină mai moale după bloc pre-topiturii într-un termostat; 2) respirație pe suprafața blocului (rewarming) înainte de fiecare mișcare a cuțitului peste un bloc sau ajusta bec; 3) schimba unghiul de înclinare al cuțitului.
2. Umplut materialul în timpul tăierii căderilor de masa înconjurătoare de parafină. Motive: 1) atunci când transferă o piesă într-o matriță pentru turnarea a fost răcirea acestuia; 2) Se umple cu parafina rece produse; 3) îndepărtarea insuficientă a alcool înainte de impregnare. Soluție: în prima și a doua cazuri trebuie topită într-o unitate de termostat și se umple din nou, respectând cu strictețe regula de umplere, în al treilea caz, după ce materialul de topire preliminară este transferat în mediul intermediar (pentru îndepărtarea alcoolului), apoi impregnat din nou și turnat.
3. Planul de tăiere este neuniformă, materialul este prost tăiată sau nu se taie, cuțitul sare peste suprafața blocului. Motivul - compactarea materialului la instalația electrică și de fixare. Eliminarea nu este posibilă. Este posibil să se înmoaie doar un material câteva dacă suprafața lamei de tăiere înainte de fiecare mișcare aplicat pe stratul de perie ceara fierbinte (conferindu-i apoi rece) sau respira pe suprafața blocului.
4. Secțiunile au fost răsucite, să adere la suprafața lamei mototolească. Motivele: 1) mic unghi cuțit de înclinare; 2) parafină moale; 3) la temperaturi ambiante ridicate. Soluție: 1) schimba unghiul de înclinare; 2 și 3), materialul perezalit într-un bloc de parafină solidă sau răcite prin plasarea într-un frigider înainte de tăiere (de asemenea, poate fi pus pe suprafața de tăiere o bucată de gheață).
5. Lipirea, șifonat sau ruperea de secțiuni, în special atunci când tăierea de organe bogate in oase, cartilaj și țesut conjunctiv dens se poate datora de electrificare a acestora. Soluție: loc pe lama (la trecerea decupajului) picătură de apă și respira pe unitatea de lame, porțiunea lamei și frecarea partea adiacentă a piesei de cuțit de ceară de parafină.
6. Secțiunile au fost acoperite cu sfâșiată sau brazde. Motive: 1) Nicks pe lama de cuțit; 2) parafină murdar (zgâriere dens tăiat mote și strica lama); 3) un material slab decalcifiat. Soluție: 1) și punctul de îndreptare sau mișcarea lamei în purtătorul de cuțit; 2) perezalivke în parafină pură; 3) nu pot fi eliminate.
7. Planul de tăiere nu este uniformă (albicioasă, în partea de mijloc). Motivul - lipsa de drenaj. Soluție: Unitatea de topire și care transportă materialul prin mediul intermediar alcool absolut. După deshidratarea se realizează prin intermediul unui mediu intermediar, sunt impregnate și încorporate.

Lipirea.

Pentru secțiuni de parafină pot fi prelucrate în continuare, acestea ar trebui să fie lipite pe o lamelă de sticlă în poziție redresată. Există mai multe metode de felii de unire, dar proteina de adeziune cea mai răspândită folosind glicerol.

Prepararea soluției.

Pentru proteine ​​din ouă proaspete de pui a fost adăugată o cantitate egală cu volumul de glicerol grad reactiv și agitat bine (sau puful). Soluția preparată a fost filtrată prin hârtie de filtru cutată umedă într-o sticlă curată. Pentru a preveni putrefacție proteinei la filtrat se adaugă bucăți mici de 2-3 (cu un bob de grâu) sau formalină timol (1: 100). Într-un recipient bine închis soluția este stocată pentru o perioadă lungă de timp.

Fig. 76.
Întinzându-secțiuni de parafină pe o lamelă de sticlă situată pe apă.

Pregătirea diapozitive care urmează să fie lipite trebuie făcută înainte de tăierea blocului de parafină într-un microtom, plasarea pe suprafața curățat cu grijă (cm. P.146) baghetă de sticlă mică picătură de soluție de proteină cu glicerol și frecat pentru a obține un strat uniform. Triturarea poate fi efectuată cu degetul (pre-ștergere cu vată îmbibat în eter) sau fină pânză curată. Pregătirea slide-uri, începe de tăiere bloc de parafină (vezi. de mai sus).
Există mai multe modalități de îndreptare și lipire secțiuni.

1. Dacă feliile au fost transferate desfășurare în apă caldă, apoi cu unsă diapozitiv proteină glicerină alimentată într-o poziție oblică sub feliile plutitoare le trage pe sticla cu o perie sau un ac de disecție (Fig. 76) și să le atașați în poziția corectă. Feliile trebuie să fie poziționate oarecum excentrică la un capăt al culisei a fost mai liber (când un astfel de aranjament este mai mult spațiu pentru a eticheta și necesită cantități minime de reactivi în prelucrarea sticlei în pahare). Apoi, excesul de apa a fost îndepărtată (și înclinarea ușoară a sticlei care deține secțiuni tiv de parafină), așezate pe plăci de sticlă și plasate într-un cuptor incubator sau uscare (la 42-45 ° C) timp de 24 de ore și în care uscarea finală are loc și felii de încleiere. Și pot fi uscate la temperatura camerei, prevenind astfel praful de secțiuni, dar mai în măsură să le reziste 36-48 ore.
2. Dacă secțiunile transferate din cuțitul direct pe proteina unsă cu diapozitive glicerol microscop, ele pot fi un băț diferit.

Procesul umed. Pe sticla folosind o pipetă se aplică câteva picături de apă distilată fiartă și secțiuni plutitoare au fost preparate. Sticla este apoi încălzit cu grijă peste o lampă de alcool și de a realiza secțiuni complete de îndreptare. Ar trebui să evite supraîncălzirea, deoarece topirea cerii provoacă daune tăietura.
În anumit nivel de calificare de încălzire este destul de ușor să se determine prin aplicarea pe suprafața inferioară a geamului pe suprafața din spate a periei (temperatura de sticlă nu trebuie să provoace senzații de arsură). Pentru această metodă de îndreptare industriei produce aparate electrice speciale „Dispozitiv de uscare și îndreptare secțiuni de parafină“ (TU 64-1-38-73).
Unitate O mare suprafață de lucru (250 x375 mm) permite poziționarea pe masa 45 pahare simultan. Dispozitivul este alimentat de alimentare AC (tensiune de 127 sau 220). Un tabel plasat lângă microtom. Înainte de tăiere capacul este îndepărtat, include dispozitivul în rețea. La proteina lame de sticlă acoperite aplicat mai multe picături de apă distilată, plasate pe o masă. Made peria tăiată este transferată pe sticlă. Dupa apa excesul de îndreptare a fost îndepărtat din nou așezat pe geamul masă să se usuce, după care sticla se taie cu deplasare pe masă și protejează împotriva prafului înainte de vopsire.
Metoda uscată. Plat perie (nu prea moale) este presat față de o margine a feliei la diapozitiv, apoi transportate cu grijă în jurul felie de relaxare și îndreptare l. După aceea, perie tăiat presat de sticlă, astfel încât între suprafața inferioară a geamului și nu lasă bule de aer, și se încălzește repede peste flacăra slabă a unei lămpi spirit (nu se va încălzi!). Ca rezultat al coagulării felie de proteine ​​este lipit ferm la diapozitivul și poate fi supus direct la prelucrarea ulterioară fără uscare.
Lipsa de lipire uscată, care tăieturi subțiri și delicate sunt ușor deteriorate și slab îndreptate, astfel încât este aplicabilă nu întotdeauna.
În acele cazuri în care prezența stratului belkovoglitserinovogo nedorit se pot lipi secțiuni cu apă distilată sau alcool 30%. În această metodă, slide-urile trebuie să fie degresate cu atenție, deoarece în caz contrar apa distribuite inegal pe sticla si shear prost lipite. Metoda de lipire este destul de simplu: sticla este aplicat apa (sau 30% alcool) și este plasat partea lucioasă în jos secțiuni; apoi încălzit, îndreptați, apa este îndepărtată și se usucă așa cum este descris mai sus.
Calitatea lipire felii determinate prin tratarea lor cu partea de sticlă, care sunt ținute într-o poziție înclinată. Dacă feliile apar mată, aderența este bună, dacă există porțiuni, strălucitoare ca o oglindă, și apoi se taie între stratul de sticlă și aerul este cel care nu a avut loc acest punct de lipire. Aceste secțiuni au fost prelucrate ulterior cu sticla să alunece cu ușurință. De obicei, un strat de aer se produce o puritate insuficientă atunci când a diapozitivului sau un cuptor de temperatură prea scăzută. A preveni alunecarea de tăieturi poate fi realizată prin tselloidinovoy de protecție.
Notă. Stai felii în apă caldă trebuie redusă la minim, deoarece în caz contrar se poate produce umflarea țesutului conjunctiv (în special atunci când blocarea în lichide care conțin acid tricloracetic și acid picric), dizolvarea și levigarea anumitor substanțe în compoziția țesuturilor.