Luând și fixare - pentru practica histologist

MATERIALE DE COLECTARE ȘI FIXAREA

(G.A.Merkulov tehnologie curs patologogistologicheskoy - .. 1967.

Cele mai importante condiții de obținere a preparatelor histologice de înaltă calitate sunt:

1. mai devreme posibil primirea materialului,

2. trauma tisulară minimă,

3. fixarea adecvată.

TĂIEREA TECHNOLOGY MATERIAL

Zona optimă a pieselor de țesătură cu 2 - 3 cm 2. Grosime 5 - 7mm.

piese sculptate de pânză direct din lama este cufundat în încuietoare. Inacceptabil piese de stoarcere, spălându-le cu apă și curățarea suprafeței corpului, în special la nivelul mucoasei, unelte, degete, etc. După imersarea pieselor într-un recipient cu o clemă este coborâtă la același număr de etichete (marcaje cifrare) scrise în creion sau cerneală pe o hârtie fotografică mată de suprafață. În cazurile în care este necesar să se eticheteze fiecare piesă, aceasta, împreună cu o etichetă legată într-o pungă de tifon. De asemenea, este posibil ca înșirare de piese filetate: primele 2 - 3 ori a primei piese este cusută eticheta, atunci el felie, apoi eticheta următoare și așa mai departe până la 10-15 bucăți.

În Samara OBSME a avut loc, de asemenea, marcarea bucăți de corpuri pe carton cu semnăturile cerneală indelebilă, după tăierea bucăți de carton marcate plasat într-un nod cu tifon tunse o bucată.

În prezența unor zone anormale de piese de țesuturi și organe tăiate la granița cu țesutul normal.

Bucăți de organe tubulare sunt tăiate, astfel încât, în preparatul erau vizibile toate straturile peretelui. peretele Feliile al corpului gol la interior, care este răspândit în prealabil pe hârtie fotografică sau carton.

Pentru a studia peretele vasului pe o suprafață mare este tăiată pe lungime, se rostogolească într-o rolă și cusute în mijloc.

Pentru a studia în vrac de țesut conjunctiv preparat medicamente filmy: după disecție atentă a conjunctive penseta bandă trageți pentru a răsfoiesc o lamelă de sticlă și fixe.

PRINCIPII GENERALE DE FIXARE

Fixation stabilizează structurile de țesuturi și sigiliul lor. Mecanismul de acțiune se bazează pe proteine ​​clipuri de coagulare și stabilizarea lipidelor.

Fixation conduce întotdeauna la schimbări mai mari sau mai mici, în structura și volumul țesutului, al căror severitate depinde de pH-ul dispozitivului de reținere, concentrația acesteia, temperatura, durata de expunere și de alți factori. Concentrația ionilor de hidrogen clichetul trebuie să se potrivească cu cea a țesuturilor, cu toate acestea de reținere trebuie să aibă un pH aproape neutru. blocare Creșterea temperaturii accelerează procesul, dar este încă o mare schimbare în țesuturi. Fixarea prea lung duce la o compactare semnificativă a materialului, ceea ce complică și mai mult manipularea acestuia. Pentru fiecare tip de studiu selectat de fixare cel mai adecvat. Cei mai puțin Deformarea vor fi supuse unor structuri de țesut în timpul fixării, cu atât mai repede și mai profundă va fi efectul lor asupra materialului, fluidul fixator mai bine este considerat.

O fixare completă a materialului furnizat în anumite cerințe.

1. După tăierea o bucată de țesut a fost imediat cufundat în broască.

2. Volumul zăvorului trebuie să depășească cantitatea de material latched de 10-20 de ori. deoarece lichidul tisular poate schimba în mod semnificativ concentrația opritorului.

3. În cazul în care se schimbă culoarea broaștei după scufundare în bucăți ea de tesatura, clemă trebuie schimbat imediat.

4. Evitați utilizarea de cleme repetate.

5. Pentru fiecare dispozitivul de blocare care trebuie respectate set timp de fixare. Expunerea prelungită a materialului este posibilă numai în anumite cleme, cum ar fi 10% formalină neutră, fluid Bouin.

Pentru a rezolva mai bine să folosiți recipiente cu gât larg, astfel încât nu probleme cu îndepărtarea materialului fix. Uniformitatea fixare pierde anumite țesuturi, cum ar fi plamani, aceasta se realizează prin plasarea lor pe partea de jos a băncilor, iar deasupra lor - de stabilire a unui strat de tifon sau bumbac. Această tehnică permite evitarea pieselor de fixare defect de țesut pulmonar sub formă de adeziunea la mănuși de cauciuc care acoperă borcanul cu dezvoltarea ulterioară a unei piese de autoliză. Cu un număr mare de bucăți de material din bumbac sau tifon strat intermediar.

Majoritatea materialului este fixat la temperatura camerei, dar pentru anumite tipuri de studii (histochimie, microscopie electronică, etc.) trebuie efectuată fixarea la 4 ° C Biopsiile urgente Material fixat la conservant temperatură ridicată. La fixarea rapidă în adâncimi obiectului dezvoltare rapidă a proceselor autolitice.

Pur și simplu stabilește FLUID

Formalina. Principalul fixativ frecvent utilizat este formol, care este o soluție de formaldehidă 40%. Din aceasta se prepară neutru (tamponat la pH 7,0) 10-12% formalină. Pentru a face acest lucru într-un borcan cu 40% formalină turnat carbonat de calciu sau magneziu sau un amestec al acestor săruri - dolomit rată de 100 g per 1 litru de formalină. Pentru formol neutru 10% la 24 de ore până la 1 parte la 40% formalină neutră a fost adăugat 9 părți de apă de la robinet. Durata de fixare 24-48 ore la 20 ° C

clemă universală, potrivită pentru cele mai multe studii histologice și histochimice, este un formol neutru pentru Lilly.

A. 100 ml de 40% formol + 900 ml apă distilată.

B. 4 g monohidrat monosodic ortofosfat (fosfat diacid de sodiu).

B. 6,5 g dibazic de sodiu (fosfat disodic).

În cazul în care partea de jos a borcane de 40% formalină sa format un precipitat alb (paraformaldehida), acesta poate fi dizolvat, încălzit până la 70-80 ° C (într-o glugă!), Și utilizat pentru fixare.

alcool etilic (80%, 90%, 96% și 100%). Este folosit ca un conservant pentru detectarea glicogen, fier, amiloid, dar se dizolvă lipide. Mecanismul de acțiune se bazează pe precipitarea proteinelor. acest lucru este însoțit de facilități de deshidratare, care accelerează semnificativ instalația electrică. Durata fixării de la 2 ore până la 1 zi. Creșterea lungimii de fixare, în special în alcool 100%, nu este de dorit deoarece materialul este compactat în mod considerabil și apare overdrying. Temperatura optimă pentru fixarea materialului într-un alcool 4 ° C, dar poate fi efectuată la temperatura camerei. În cazul în care, după fixarea alcool de tesut pentru a fi tăiate pe un microtom de congelare sau criostat, piesele spălate timp de 1-2 ore înainte de scufundare pe fundul băncilor, în care țesutul este saturat cu apă.

Acetonă (efectul său alcool similar). Acetona este utilizată pentru a crește viteza de fixare. Se aplică 100% acetonă pentru a se obține acetonă se toarnă într-un sulfat comercial calcinat cupru (bluestone) sau silicagel. În acetonă fix felii de 3-4 mm grosime, timp de 2 ore la 20 ° C sau 30 minute - 1 oră într-un termostat la 60 ° C într-un recipient închis ermetic. Acetona sigilează substanțial țesutul și prin prelungirea fixarea poate ridarea obiecte. Majoritatea acetonei este utilizat pentru procesarea materialului la biopsii sale urgente turnat în parafină.

clorură de mercur (diclorură de mercur). Sulemu folosit ca un conservant pentru debutul histologie. Se prepară o soluție saturată de 10 g de clorură mercurică în 100 ml apă distilată sau soluție izotonică de clorură de sodiu adus la fierbere, se răcește și se filtrează. Durata pieselor de fixare 3 mm grosime de 6-12 ore la 20 ° C La fixarea clorură mercurică poate să apară în țesuturile unui precipitat cristalin, care este îndepărtat prin tratarea felii iodați alcool 70% (50 ml alcool 70% - 5-10 picături de soluție 5% alcool de iod până apare o culoare portocalie). Ca alcool albire iodurate cu secțiuni este înlocuit cu o porțiune proaspătă până la pierderea completă a culorii, iar apoi secțiunile au fost spălate în 3 - 4 schimbări de alcool de 70%.

Piesele componente sunt cleme complicate simple. Există mai multe variante ale amestecurilor de fixare. Următoarele sunt cele mai frecvente.

Formol-alcool cu ​​Schaffer - 10% formalină neutră, care este preparată din 1 parte 40% formalină neutră și 2 - 3 părți alcool 96%.

Durata de fixare 24-48 ore. Apa de spălare suplimentară nu este necesară, iar materialul este pus imediat în alcool 96%.

40% 100ml formol neutru

Clorură de sodiu 8,5 g

Apa de la robinet 900 ml

Durata fixării 48 ore la 20 ° C, urmată de spălare în apă curentă timp de 6-12 ore.

Buena lichid - un sistem de blocare clasic pentru cercetare experimentală.

soluție saturată de acid picric 75 ml

Neutral 40% formalină 25 ml

Acid acetic glacial 5 ml

Fixarea Durata 1-24 ore la 20 ° C

O soluție saturată de acid picric se prepară în pe bază de acid picric 3a cristalin avans în 1 litru de apă distilată fierbinte. După ce piesele de fixare sunt spălate de exces de acid picric în etanol 70%, apoi înglobate în parafină.

Calciu-formol de Baker utilizat pentru fixarea lipidelor.

A. 10 ml de 40% formol + 90 ml apă distilată.

B. 1 g de clorură de calciu.

Soluțiile A și B au fost amestecate.

Durata de fixare 24-48 ore la 20 ° C

fluid de Carnoy lui - suport universal pentru cele mai multe studii histologice și histochimice (cu excepția celor pentru detectarea lipidelor).

Alcoolul 100% 96% sau 60 ml

Cloroformice 30 ml

Acid acetic glacial 10 ml

Fixarea Durata 2-4 ore la 4 ° C sau 1-2 ore la 20 ° C Materialul a fost apoi plasat în alcool 100%. Dacă materialul nu este direct supus cablajului, acesta poate fi transferat în alcool 96% și țineți acolo până la 3 zile.

KarnuaI folosit ca opritor, compus din 100% alcool ml 75 și 25 ml de acid acetic glacial. de stabilire a condițiilor sunt aceleași.

În absența alcoolului etilic în loc de fluid Carnoy poate fi un amestec cu următoarea compoziție.

alcool izopropilic 60 ml

Acid propionic 30 ml

Durata de fixare 12-24 ore la 20 ° C; Alcoolul izopropilic este utilizat pentru spălare și deshidratare.

NORME de fixare

Practic, toate încuietorile sunt substanțe toxice (aldehide, acetonă, alcool), anumite toxice (clorură mercurică, tetraoxid de osmiu, metanol), și, prin urmare, trebuie să respecte reglementările de siguranță pentru manipularea reactivilor care sunt utilizați în practica histologică.

Fixation și materialul de tăiere trebuie să fie făcut într-o hotă. Materialul recuperat din opritorul care conține formol, de preferință, în câteva minute, se spală sub jet de apă sub formă de vapori de formol sunt iritante pentru membranele mucoase ale ochilor și organelor respiratorii.

artefacte posibile legate de fixare,

ȘI SOLUȚII

Când formalina fixare, în special acid, pot apărea în secțiunile de pigment brun închis sub formă de granule sau smocuri (rezultatul reacției cu țesuturile hemoglobinei formol). Pigment a fost îndepărtat prin plasarea feliile timp de 15-20 min, la o soluție de amoniac 1-5% sau 70% alcool. După spălare cu apă, preparatul poate fi vopsit. Good pigment este îndepărtat într-o soluție de hidroxid de potasiu 1% în etanol 80% (01:25) după expunerea la 10 minute de droguri a fost spălată cu apă curentă timp de 5 minute.

In cazurile de rezultat sigiliu țesut semnificativ în bucăți de fixare prea lungi au fost plasate timp de 1-2 ore în soluție de acid citric 10% (materialul devine mai moale și mai potrivite pentru cercetare).

Precipitatul cristalin format după fixare cu clorură mercurică este îndepărtată din bucățile sau felii este mai bine folosind iodurate alcool 70%.

micropreparatelor Histologist studiul ar trebui să ia în considerare o serie de posibile artefacte cauzate de fixarea materialului:

1. Dezvoltarea autoliză țesut la instalațiile la scară mare sau de fixare slabă, evaluarea secțiunilor este limitată (este imposibil în mod fiabil pentru a exprima gravitatea edemului tisular, severitatea modificărilor distrofice în celule, reacția celulei, ca dezintegrarea elementelor celulare pe autoliza fundal) .

2. Compresia țesuturilor la fixarea lor (poate fi de până la 40% din volumul inițial) și umflarea țesutului în timpul fixării conduce la artefacte când mikromorfometrii (de exemplu, creșterea numărului de leucocite în câmpul vizual al microscopului în timpul fixării țesuturilor moi ale obiectului 72 de ore sau mai mult, în comparație la aceeași bucată de țesut moale, un fix 24-48 ore)

3. rănire mecanică a țesutului nervos la deschiderea craniului, studiu creier - contracție, hyperchromia neuronale Nuclei deformarea lor,

4. artefact permanent în SNC - decalaj perivasculare și pericelulare greșit diagnosticat ca edem pericelulare și perivasculară, și altele.

Fig. 6, 7. Focare putrefacție emfizem în țesutul renal, exprimat autoliză. Hematoxilina-eozină. Creșterea X100.

semne histologice postmortem de congelare țesuturilor de la cadavre.

La tesut post-mortem congelare lor sub microscop în ac vizibil sau în formă de fagure defecte rotunde ovale (pauze urme de particule de gheață topite). În această stare de țesuturi pentru a vorbi despre authentically umplerea lor de sânge, prezența și severitatea edem, un număr de stări patologice nu este posibilă.

Fig. 1, 2. semne postmortem de congelare în miocard sub forma dens aranjate rotunjite oval defecte în formă de fagure, golurile, împotriva modificărilor autolitice moderat exprimate. Hematoxilină-eozină, creșterea X100 și H250.