Izolarea și cultura virusului

Izolarea și identificarea agentului cauzal - „standardul de aur“ în diagnosticul infecțiilor virale.

Virusurile se replica numai in celulele vii si recuperarea agentului patogen în cultura de celule infectate - una dintre metodele de bază de diagnosticare a infecțiilor virale. Deoarece majoritatea virusului patogen este specificitate de țesut diferit și modelul, apoi aproape fiecare virus putem alege culturile de celule sau de țesuturi adecvate, precum și crearea unor condiții standard de cultură (prezența celulelor de același tip). Virus Înmulțire furnizează celule sensibile (permisive). Prin urmare, alocarea unui agent patogen necunoscut se efectuează o singură dată contaminarea culturilor de celule 3-4, presupunând că una dintre ele poate fi permisivă. Culturile de celule sunt preparate prin dispersarea organele și țesuturile respective, dar folosesc adesea țesuturile fetale (umane și animale) sau celule tumorale transformate. Atunci când sunt plasate pe o suprafață plană corespunzătoare culturilor celulare de obicei cresc ca un monostrat.

Cultura tripsinizate primar. Suspensiile sunt preparate prin omogenizarea celulelor țesăturilor pretratate cu tripsină corespunzătoare. Culturile prezintă adesea un tip de celule mixte și nu sunt supuse cultivării repetate. Viabilitatea acestor culturi este de aproximativ 2-3 săptămâni.

Poluperevivaemye linia de celule diploide prezintă celule umane și animale. Culturile potrivite pentru limitată re-dispersibility și o creștere (de obicei, nu mai mult de 20-30 treceri), în timp ce menținerea viabilității și fără a fi supusă unei transformări spontane.

Linia celulară continuă (cultura heteroploid) prezentate cu celule supuse cultivării prelungite și transformări spontane. Cultura capabilă dispersia și multiple perevivaniyu. De lucru cu ei mai puțin laborioase în comparație cu preparatele din culturi primare; Celulele transplantabile sunt relativ similare în proprietățile lor morfologice și de stabilitate.

Nu toate tipurile de celule sunt în măsură să crească ca un monostrat, în unele cazuri, menținerea celulelor diferențiate este posibilă doar cultura de organe. De obicei, această suspensie de țesut, care are o funcție de specialitate, de asemenea, menționată ca cultură de țesut se confruntă.

embrioni de pui - aproape model perfect pentru cultivarea unor virusuri (de exemplu, gripa si rujeola). cavitate închisă a embrionului împiedică pătrunderea microorganismelor din exterior, precum și dezvoltarea infecțiilor virale spontane. Embrionii utilizate pentru izolarea virusului primare din materialul patologic; pentru depozitarea acestora și pasaje, precum și pentru a obține cantitățile necesare ale virusului. Unii agenți patogeni (de exemplu, virusurile herpetice) cauzează modificări caracteristice (așa cum este posibil pentru a detecta boala). Infecția se realizează pe membrana-chorio alantoamniotic, cavitatea amniotică sau alantoidiană, sau în sacul vitelin.

Infectarea pe membrană chorio alantoidian. folosesc de obicei embrioni 10-12 zile. Ouăle sunt de vizionare în lumina transmisă, marca Locul de amplasare a pungii de aer și alege zona fără a vaselor de sânge. Se îndepărtează cu grijă fragmentul coajă, mantaua exterioară în vrac și curățate cu grijă de presiune. Apoi, face o gaură la marginea pungii de aer. Când aspirare teaca chorio-prin aceasta alantoamniotic este jupuit de pe învelișul exterior. Pe materialul de testare i se aplică, fără bacterii și protozoare (trecut printr-un filtru bacterian și bactericide tratate).

Infectia cavitatii amniotic. folosesc de obicei embrioni 7-14 zile, in care dupa peeling membrana chorio alantoidian (cm. mai sus) se extind de deschidere de prindere forceps membrană amniotic și retrase prin-corionică membranei alantoidian. După ce este administrată în cavitatea amniotică a materialului de testat.

Infecția la alantoidian micimii. embrioni de 10 zile sunt infectați prin găurile făcute în coajă și membranele care stau la baza (vezi. de mai sus).

Infecția în sacul vitelin. utilizați 3

embrioni de 8 zile, care au la această vârstă sacul vitelin ocupă aproape întreaga cavitate a oului. Infecția se realizează printr-o gaură făcută în punga de aer

Monitorizarea și contabile rezultate. Ca un material care conține virus este posibil să se utilizeze conținutul sacului vitelin, amniotic si alantoidian embrionul fluid sau întreg feliate împreună cu țesutul înconjurător în bucăți. Pentru a identifica leziuni caracteristice pe horion- embrionat in curs de dezvoltare.

membrană alantoidian este îndepărtată și învelișul carcasei exterioare. Membrana a fost apoi îndepărtat și pus în apă sterilă. învinge studiu de personaj pe un fundal întunecat.

Dacă este imposibil să se izoleze și identificarea virusului in vitro prin metode standard materiale infecțioase administrate animalelor sensibile la agentul patogen, și după dezvoltarea procesului infecțios tipic se realizează culturi de celule sensibile la reinfectare. folosesc cel mai adesea șoareci, iepuri și maimuțe; pentru a evidenția unele virusuri (cum ar fi virusurile Coxsackie) infectează șoarecii iziți. Din cauza costurilor ridicate și complexitatea animalelor de laborator de conținut suplinit aproape universal culturi de celule lor. Cu toate acestea, modelele animale sunt utilizate pe scara larga pentru a studia patogeneza și caracteristicile formării răspunsurilor imune la infecțiile virale.

Activitatea biologică a virusului prezenței și este determinată de efectele observate la modelele animale (temperatură ridicată a corpului, apariția semnelor clinice caracteristice, decese etc.), ouă de pui, și pe celulele (în culturile). Sub influența virusurilor specifice, este posibil să se schimbe morfologia, creșterea, reproducerea celulară sau distrugerea acestora. multiplicarea virusului în celulele sensibile fapt in vitro este determinată de efectele citopatice (inclusiv placi, corpuri de incluziune), fenomen gemadsorbtsii de „reacție de culoare.“

Efectele citopatic sunt evaluate de culturi de celule de microscopie. Prin gradul de deteriorare celulară este izolat virusuri cu citopatic ridicată sau moderată. replicarea virusului în culturi celulare este însoțită de încălcări ale morfologiei celulelor monostrat. Unele virusuri determina modificări citopatice caracteristice, care (ținând cont de tabloul clinic) vă permite să facă rapid un diagnostic preliminar. De exemplu, multiplicarea paramixovirus (virusul rujeolei, oreionului, PC-virus) este însoțită de apariția celulelor gigante multinucleate caracteristice; Adenovirusurile determina formarea de grupuri mari de celule rotunde și în reproducerea celulelor formei herpesvirus rotunde situate difuz prin monostrat.

Plaque. „Plachete“ sunt numite colonii negative - parcele perturbate celule care arata ca zona de iluminare de pe monostratul de celule acoperite cu un strat de agar-agar. În unele cazuri, doza și virus citopatogen exprimată în unități (pfu) placi formatoare.

Corpii de incluziune. Multe virusuri determina celulele infectate care apar în formațiuni caracteristice - acumularea de proteine ​​virale sau particule care sunt vizibile în lumina microscopului. Corpii de incluziune poate fi localizată în citoplasmă (Guarneri vițel cu variola) si in nucleele celulare (adenovirusuri).

Absența CPE. Unele virusuri (de exemplu, virusul rubeolei) nu prezintă un efect citopatic. Acestea pot fi identificate prin interferența unui alt virus cunoscut de a provoca degenerarea celulelor infectate.

gemadsorbtsii fenomen. Multe virusuri celulele infectate dobândesc capacitatea de a adsorbi pe suprafața diferite celule roșii din sânge. Fenomenul are mecanisme gemadsorbtsii comune cu hemaglutinare și se manifestă în stadii incipiente, înainte de debutul efectului citopatic, în absența sau exprimarea slabă.

„Reacția de culoare“. Mediul de cultură utilizat pentru menținerea celulelor, ceea ce face indicatorul. Creșterea celulară este însoțită de acumularea de metaboliți, o schimbare a pH-ului și un indicator de schimbare a culorii. Infecția cu culturile virale inhibă puternic metabolismul celular și mediul își păstrează culoarea inițială.

diagnostic rapid. Pentru identificarea rapidă a infecției virale a dezvoltat numeroase metode de diagnosticare rapida bazate pe detectarea Ag virale. De exemplu, pentru un diagnostic precoce al infecției cu HIV este utilizat pe scară largă ELISA care detectează virusul Ar superficial.