Identificare (afișare) de detectare a virusului a virusului in embrioni de pui
De identificare (afișare) viruși
Detectarea virusului in embrioni de pui
2.Poyavlenie miros la necropsie
fluid de 3.Pomutnenie în cavitatea
4. Formarea de ulcere și sângerare pe cojile
Metoda biologică a studiului este infecția virusului este sensibil la materialul de testare pe animale, studiul patologiei și tabloul clinic al bolii. În această metodă, diferite animale: maimuțe, iepuri, cobai, câini, șoareci, șobolani. moduri de infectare: subdurale, intracerebrală, intranazală, și altele.
Metode pentru detectarea virusului în organismul animalelor de laborator diferă în funcție de tipul de animal și tipul de virus.
Detectarea virusurilor în culturi celulare
Identificarea efectului citopatic (CPE). CPE este modificări degenerative ale celulelor care sunt rezultatul reproducerii unui virus.
Distinge degenerare completă și parțială a monostratului de celule.
La degenerare completă, cauzate, de exemplu, virusul poliomielitei, Coxsackie și ECHO, un monostrat de celule supuse unor modificări semnificative, mai multe dintre ele sunt exfoliate de pe sticla. Celulele unice rămase ridat
degenerare parțială are mai multe soiuri:
Style grozdeobrazovaniya (adenovirusuri);
În funcție de tipul de distrugere focale (variola, gripa);
3.Po simplastoobrazovaniya tip (rujeolă, oreion, paragripale, herpes, HIV).
tip proliferativ de schimbare este caracteristic un virus oncogen, transformarea în celule maligne.
. Incluziuni intracelulara formate în reproducerea unor virusuri în citoplasmă și nucleul celulelor (variola, rabie, gripa, herpes etc.) Ele prezintă la microscop după colorare monostrat cu Romanovsky - Giemsa, precum si microscopie de fluorescenta.
Culoare eșantion Salk. Ca rezultat, activitatea celulelor într-un mediu de cultură pentru a acumula alimente acide. Ca urmare, culoarea care este o parte a mediului indicator (roșu fenol) devine portocalie. După infectare, culturi de celule, cum ar fi virusurile citopatice enterovirusuri si reovirusuri, metabolismul celular este suprimată, iar pH-ul mediului nu schimbă culoarea (mediu roșu rămâne).
Hemaglutinarea. Baza acestei reacții este abilitatea virusurilor care conțin hemaglutinină-receptori „lipici“ eritrocite. Dacă există un hemaglutinina - RGA + (umbrelă de soare), în cazul în care nu - RGA - (butoane).
gemadsorbtsii reacție. Mecanismul este similar cu DSA.
1. Pentru diagnosticul microbiologic al infecțiilor virale următoarea abordare metodologică de bază
A) Diagnosticul bacteriologic;
b) diagnosticarea virusologice;
c) diagnosticul serologic;
d) diagnosticare moleculara biologice.
2. Virusuri multiplica numai:
a) în sistemele vii;
b) pe agar simplu;
c) de pe suportul-diagnostic diferențial;
g) în mediul de selecție.
3. Prima etapă de diagnostic virusologic este de a obține și de a pregăti
a) culturi celulare;
b) embrioni de pui;
c) animalele sensibile de laborator;
d) un mediu-diagnostic diferențial.
4. Identificarea Virusuri:
A) Prin efect citopatic;
b) La formarea plăcilor;
Mostră culoare VPO;
g) Prin proprietăți biochimice.
5. Detectarea virusului in embrioni de pui
A) pentru a schimba membrana corioalantoica;
b) RGA (aglutinare);
în RNC (completarea reacției de fixare);
d) RP (reacția de precipitare).
6. Ce este bacteriofagul?
c) celulele fagocitare;
microbii 7.Ce nu au structura celulara?
8. Ce conține virusul este dificil de a organiza?
a) două tipuri de acid nucleic;
b) un tip de acid nucleic (fie ADN sau ARN);
9. Virusuri deschis:
10. Forma extracelulară a existenței virusurilor
d) organismele elementare.
ocuparea forței de muncă practic № 9
Subiect: Metoda Fundamentele genetiki.Molekulyarno-biologică a diagnosticului. reacția de polimerizare în lanț și variantele sale.
1. Pentru a studia metodele de transmitere a informației genetice între bacterii:
transducția, transformarea și conjugare.
2. Aflați elementele de bază ale biotehnologiei și ingineriei genetice.
Studentul trebuie să știe:
1. Formele de variație microbiană.
2. Condițiile pentru apariția variabilității microorganismelor, semnificația lor practică.
3. Esența biotehnologiei, scopurilor și obiectivelor.
4. Microorganismele și procesele utilizate în biotehnologie medicală.
5. Utilizarea ingineriei genetice în domeniul biotehnologiei.
6. microorganisme de recombinare genetică.
1.Uchest de transformare experiență.
2. Să ia în considerare rezultatele transducerea experimentului.
3. Luați în considerare rezultatele conjugării experimentului.
1. Biotehnologie medical.
2. Genetic recombinare: transductia, conjugarea, transformare
3. Rolul recombinare genetică în ingineria genetică și medicală
4. Utilizarea plasmidelor în cercetarea ingineriei genetice.
5.Primenenie metode biologice genetice și moleculare
diagnosticul bolilor infecțioase: PCR, metoda de sonde moleculare.
6.Biopreparaty obținute prin inginerie genetică (vaccin
anticorpi monoclonali, hormoni și instrumente de diagnosticare).
Munca independentă de elevi
1.Uchet rezultatele experimentale ale transformării.
2. Pentru a ține seama de experiența transducție.
3. Pentru a ține seama de experiența conjugare.
4.Ukazat răspunsuri corecte în testele.
Informațiile materiale activități conexe
Punerea în scenă o experiență de transformare
Recipient - tulpina BacillussubtilisStr (bacilul fân, sensibilă la streptomicina); donator - ADN izolat din tulpina V.SubtilisStr (rezistentă la streptomicină). mediu selectiv pentru selectarea recombinării Nantes (transformanți) Agar nutritiv care conține 100 U / ml streptomicină.
La 1 ml de B. subtilis cultură bulion se adaugă 1 mg / ml soluție DNază în 0,5 ml de soluție de clorură de magneziu pentru a perturba ADN-ul nu a pătruns în celulele bacteriene tulpina recipient și au fost incubate timp de 5 min. Pentru a determina numărul recombinanților formate streptomicină (transformante) amestec de 0,1 ml de nediluat sunt etalate pe medii selective într-un vas Petri. Pentru a determina numărul de culturi celulare recipient în soluție de clorură de sodiu izotonică preparată 10 diluții de 10 -5 -10 -6 (pentru a fost numărat numărul de colonii), însămânțat cu 0,1 ml de streptomicină fără agar nutritiv și pentru controlul - agar streptomicină. În cele din urmă mediul de cultură destinatar nu ar trebui să crească, pentru că este sensibil la streptomicină. Însămânțarea a fost incubat la 37 0 C. A doua zi, rezultatele experimentale luate în considerare, și se determină cantitățile relative de frecvență de transformare cultivate celule recombinante printre celulele tulpinii receptoare.
Să presupunem că atunci când însămânțarea 0,1 ml cultură tulpină retsipi-entnogo la o diluție de 10 -5 170 colonii au crescut, iar când semănat 0,1 ml amestec nediluat - 68 colonii ale tulpinii recombinante. Deoarece fiecare colonie a fost format ca urmare a reproducerii doar o singură celulă bacteriană în 0,1 ml de cultură recipient inoculată conține 170 x 10 celule viabile mai, și 1 ml - 170 x 10 6 sau 1,7 x 10 8. În același timp, 68 este timpul celulele recombinante în 0,1 ml și 1 ml - 680, sau 6,8 x 10 în februarie.
Astfel, frecvența de transformare în acest experiment va fi egal cu:
Experiența specifică Staging transducție
Recipient - tulpina E. coli lac -. lipsit de controlul fermentației lactozei operon 3-galactozidaza. Transducția fagi -. Fagul X Gal, în care o porțiune a genei genomului (operator 3-galactozidaza substituit, Ron E. coli este defect, care este în imposibilitatea de a provoca o infecție productivă terminare liză a E. coli și este notat cu d (fagul Gal .. ) cu denumirea conținută în genomul unui mediu bacterian de selecție operon gal -. Miercuri Endo pe care laktozootritsatelnye bacteriile tulpina receptoare formează colonii incolore și colonii ale tulpinii recombinante lactoză devin roșii cu tentă metalică . La 1 ml dintr-o soluție de cultură de 3 ore a tulpinii recipient, 1 ml transducă fagic Gal o concentrație de 10. 6 - 10 particule Iulie în 1 ml Amestecul a fost incubat timp de 60 min la temperatura de 37 0 C, apoi se pregătește o serie de diluții de 10 ori (în în funcție de concentrația așteptată a bacteriilor) pentru a obține un număr de colonii a fost numărat. din tuburile de diluție 10 -6 make însămânțare 0,1 ml cultură pe 3 cutii Petri cu mediu de Endo și lichidul cu o spatulă pe suprafața medie este distribuit uniform.
Culturi au fost incubate timp de 1 zi, după care se indică rezultatele experimentale și numărul calculat de transductie relativă de celule de frecvență recombinanților (duktantov trans) găsit pe toate plăcile, printre celula sușă recipient.
De exemplu, după inoculare cu 0,1 ml de cultură amestecată la o diluție de 10 -6 3 cesti cu mediu Endo a crescut, respectiv 138, 170 și 160 de colonii incolore ale tulpinii beneficiare în primele și ultimele plăci - 5 și o transducție colonii roșii. Prin urmare, frecvența transductie este apoi egal cu:
Formularea experiență de conjugare pentru a transfera un fragment de cromozomi care cuprinde genleu controlează sinteza leucina.
Donor - tulpina E. coli K12 Hfr leu Str S; Recipient - tulpina E. coli K12 F - leu + Str R. Hfr - denumire Status, ceea ce este caracteristic pentru recombinare de înaltă frecvență. mediu selectiv pentru izolarea recombinanților glyukozosolevaya un mediu minimal: KH2 PO4 - 6,5 g, MgSO4 - 0,1 g, (NH4) 2SO4 - 1 g, Ca (NO3) 2 - 0,001 g până FeSO4 - 0,0005 g glucoză - 2 g, streptomicina - 200 U / ml de apă distilată - 1 litru.
La 2 ml dintr-o cultură de 3 ore, 1 ml de donator cultură recipient bulion. Culturi au fost incubate la temperatura de 37 0 C timp de 30 min. Amestecul a fost apoi diluat la 10 -2 -10 3 și însămânțate pe 0,1 ml de mediu agar selectiv într-un vas Petri pe care cresc numai colonii recombinați. Ca martori pe același mediu sunt placate donatoare și beneficiare tulpini care nu cresc în ea, adică. K. O primă tulpină sensibilă la streptomicină, iar celălalt este auxotrofica pentru leucină. În plus, cultura tulpinii donatoare sunt placate pe medii selective fără streptomicină și cultură a tulpinii beneficiare - pe un mediu complet (agar nutritiv) cu antibiotic pentru determinarea numărului de celule viabile. Culturi au fost incubate la temperatura de 37 0 C până a doua zi. După numărarea numărului de colonii se determină frecvențele de recombinare cantități relative ale celulelor recombinante către destinatar.
De exemplu, după însămânțare 0,1 ml de culturi donatoare și beneficiare în diluția 10 -2 150 colonii recombinanți crescute și după însămânțare 0,1 ml de recipient diluare cultură 10 -6 75 colonii. Astfel, frecvența de recombinare este egală cu:
reacție în lanț a polimerazei (PCR) - una dintre tehnicile genetice moleculare moderne, bazate pe principiul copierii repetate (amplificare) a unei regiuni de ADN sau ARN. In acest proces, cantitatea de ADN din proba determinată de creșteri în zeci de milioane de ori, ceea ce face posibilă detectarea ulterioară a ADN-ului amplificat. Astfel, PCR dezvăluie fragmentele ADN neglijabile specifice unui anumit tip de bacterii, si de a identifica cu exactitate această specie.
PCR în celula a fost descoperit în urmă cu peste 30 de ani, laureați ai premiului Nobel și A.Kronbergom D.Ledebergom. Principiul PCR în metoda in vitro a fost dezvoltat K.Myulisom în 1983, de asemenea, a devenit un laureat Nobel. Aproape imediat au existat rapoarte ale aplicării sale practice. Cu toate acestea, în această perioadă din cauza lipsei echipamentului necesar PCR a fost efectuată prin tuburile de transfer manual în termostate la temperatura dorită. Necesar pentru sinteza ADN-enzima ADN-polimerazei distruse după fiecare etapă de denaturare (95 ° C), cu toate acestea, este necesar adăugarea continuă a unor noi porțiuni.
In 1988 g a fost obținut ADN polimerază termostabilă dintr-o bacterie Thermophilus aquaticus, care trăiesc în izvoarele termale. Au fost elaborate dispozitive speciale pentru amplificare (Thermocycle). Creat de secventiere tehnologie laser moderne (decodificare secvențelor ADN de nucleotide). Acest lucru a condus la faptul că PCR a devenit disponibil pentru utilizarea pe scară largă în practica de laborator.