Anticorpi la peptide natriuretice proBNP

Aspectul istoric

In 1988, creier de porc a fost izolat peptida numita creier natriuretic peptide (Brain natriuretic Peptide, BNP). Sa demonstrat ulterior că BNP este exprimat predominant în cardiomiocite, așa că, în ultimii ani, folosit din ce în numele „peptidul natriuretic B-tip» (B-tip natriuretic Peptide).

Structurați peptide natriuretice

Secvența de aminoacizi a peptidelor natriuretice vysokogomologichna. Peptidele natriuretice cuprind un inel centrală care constă din 17 de resturi de aminoacizi (a.k.o.), închise printr-o legătură disulfidică între două reziduuri de cisteină și catene laterale de diferite lungimi. BNP uman are 32 a.k.o. ANP - 28 a.k.o. Pentru CNP cunoscut două forme, care constă din 22 și 53 a.k.o. caracterizat prin porțiunea de lungime N-terminală. Secvențele de aminoacizi din vysokogomologichny inelul - 11 din 17 aa sunt identice pentru toate cele trei peptide (Figura 1.).

Fig. 1. Secvența de aminoacizi a peptidelor natriuretice ANP, BNP și CNP umane. Culoarea închisă indică resturile de aminoacizi care sunt comune pentru toate cele trei peptide.

Sinteza și secreția BNP

Site-ul principal al sintezei de BNP sunt miocitelor cardiace. Expresia BNP ARNm a fost detectată în ambele atrii și ventricule. Cu toate acestea, se crede că ventriculului stâng este principala sursă de BNP în organism. Secreția de BNP in fluxul sanguin apare ca sinteza, numai cantități mici de atrial sintetizate BNP stocate în granule secretoare. Aceasta deosebește de BNP ANP, pentru care se arată că partea principală a peptidei sintetizate este stocată sub formă de molecule precursoare în granule secretoare.

Nivelul expresiei genei și secreția BNP BNP în fluxul sanguin crește semnificativ ca răspuns la o presiune crescută pe pereții camerelor inimii. Creste nivelul expresiei genei BNP este observata in diferite boli cardiace precum și boli ale plămânilor și disfuncții renale. Cu toate acestea, cea mai mare concentrație de BNP in sange se gasesc la pacientii cu insuficienta cardiaca.

BNP este sintetizat ca proBNP cardiomyocytes prohormoni, constând din 108 a.k.o. (11905 Da). Formarea hormonului activ apare ca rezultat al convertaze specific de clivaj proBNP între aa 76 și 77 (fig. 2). Clivajul proBNP duce la formarea fragmentului C-terminal al BNP (32 a.k.o. 3466 Da) și fragmentul N-terminal (proBNP N-terminal, NT-proBNP), format din 76 a.k.o. (8457 Da). Se crede că scindarea are loc proBNP fie intracelulară, fie pe suprafață cu secreție cardiomiocitelor în fluxul sanguin. Enzima, care este responsabil pentru defalcarea proBNP, nu semnificative instalat. Se presupune că una dintre cele două covertaze (furin sau Corinne) este implicată în procesarea proBNP. Ambele fragmente BNP și NT-proBNP secretat in sange intr-un raport echimolar (prin urmare, concentrația de NT-proBNP in sange, de asemenea, crește odată cu creșterea nivelului de expresie al genei BNP). Se crede că NT-proBNP nu este activ și nu are nici o funcție biologică.

Fig. 2. Schema de BNP uman.

Fiabil se arată că unele dintre moleculele nu clivat proBNP în cardiomiocite și secretată în sânge, împreună cu BNP și proBNP. Mai mult decât atât, concentrația proBNP în sânge de mai multe ori concentrația de hormon activ BNP. Mecanismele care pot duce la apariția neclivat proBNP în sânge provoacă raport ridicat proBNP / BNP concentrație în sânge și valoarea proBNP procesare parțială a organismului studiat în mod activ.

Efectele fiziologice ale BNP

BNP este un antagonist al sistemului nervos simpatic și sistemul renină-angiotensină-aldosteron, a cărei activitate este crescută în insuficiența cardiacă. Principalele efecte fiziologice ale peptidelor natriuretice:

inhibarea reabsorbție de sodiu în proximale și distale tubulilor

cresc permeabilitatea endotelială

crește natriuresis și diureza

pereți de relaxare și vasodilatație, scăderea tensiunii arteriale

crește rata de filtrare glomerulară din rinichi

inhibarea hipertrofie a cardiomiocitelor și fibroza a inimii

Factorii care afectează nivelul BNP și NT-proBNP în sânge

În prezent, BNP și NT-proBNP este utilizat pe scară largă în practica clinică ca marker biochimic al insuficienței cardiace.

La subiecții sănătoși, concentrația de BNP in sange este 10-70 pg / ml, NT-proBNP- 20-300 pg / ml. In insuficienta cardiaca, concentrare BNP poate crește până la 5 ng / ml, NT-proBNP - 100 ng / ml. concentrații mai mari de NT-proBNP in sange, comparativ cu BNP sunt asociate cu durata de viata lunga NT-proBNP în fluxul de sânge.

Cu toate acestea, nivelul de BNP și NT-proBNP in sange este crescut, nu numai in cazul insuficientei cardiace, dar, de asemenea, în alte patologii care trebuie luate în considerare atunci când se face un diagnostic (tabelul 1).

Nivelul de BNP și NT-proBNP în sânge depinde de sex (mai mare la femei decât la bărbați) și vârsta. Nivelurile de ambii markeri în sânge crește cu vârsta pacientului. În acest sens, sa propus să utilizeze valori de prag diferite, în funcție de sex și (sau) vârsta pacientului. Astfel, compania Roche recomandă utilizarea diferitelor praguri de concentrație NT-proBNP la pacienții cu vârsta sub 75 de ani (125 pg / ml) și peste 75 de ani (450 pg / ml). În același timp, se recomandă să se utilizeze un singur nivel prag de 100 pg / ml pentru toți pacienții în metodele de determinare a BNP.

nivelul hemoglobinei și greutatea corporală ca concentrația de BNP și NT-proBNP in sange afecteaza. Concentrația ambelor peptide din sânge crește cu anemie. La pacienții cu indice ridicat de masa corporala (mai mare de 25 kg / m2), concentrația de BNP și NT-proBNP considerabil mai mici decât cele cu pacienții cu greutate normală.

Metode de determinare a BNP și NT-proBNP in sange

Metode moderne de determinare cantitativă a BNP și NT-proBNP in sange se bazează pe metoda de tip imunotestare sandwich. Metoda face posibilă atingerea sensibilitate ridicată, ceea ce este extrem de important, având în vedere nivelul scăzut de BNP și NT-proBNP in sange de oameni sanatosi. Sensibilitatea metodelor existente de determinare a BNP este 1-10 pg / ml, NT-proBNP - 5-15 pg / ml.

Metodele utilizate pentru determinarea BNP pereche de anticorpi monoclonali, sau o combinație de anticorpi mono și policlonali (tabelul 2). De exemplu, unul dintre anticorpii utilizați este specifică structurii inelului și celălalt la capătul C-terminal sau N-terminal al peptidei. Deoarece peptidele natriuretice caracterizate printr-un grad înalt de omologie pentru a crea sisteme de diagnosticare sunt selectate de anticorpi care nu au reacție încrucișată cu ANP și CNP. Utilizarea de anticorpi de specificitate diferită epitop precum și diferențele în calibratoarele duce la faptul că măsurarea BNP într-una și aceeași probă obținută folosind diferite metode pot fi diferite.

* Ambele sisteme Triage și Beckman folosesc același anticorp, dar nu sunt la fel, pentru că au diferențe în abordările folosind anticorpi monoclonali și policlonali ca anticorpi detector și anticorpi substrat.

Factorii care influențează determinarea concentrațiilor de BNP și NT-proBNP

Glicozilarea molekulNT-proBNP. Partea centrală a moleculei este glicozilată NT-proBNP. Glicozilarea afectează în mod negativ măsurarea concentrațiilor NT-proBNP în sânge, deoarece reziduurile de carbohidrați interfera cu interacțiunea anticorpilor cu NT-proBNP. Epitopii utilizați în situsuri de glicozilare de anticorpi sistemele de diagnosticare sunt situate în apropierea moleculei NT-proBNP (secțiunile 39-50 și 42-46). Aceasta conduce la faptul că concentrația de NT-proBNP în probele grave (uneori de mai multe ori) este subestimat. Nivelul de NT-proBNP glicozilare diferă la pacienții, astfel încât eroarea metodei nu este constantă. Semnificația clinică a acestui nu este stabilit, în curs de investigare.

Stabilitatea BNP și NT-proBNP în probele

Pentru a determina nivelul de BNP este numai EDTA-plasmă sau sânge integral este colectat în eprubete conținând EDTA (TriageBNP). Concentrația de BNP, determinată în probele de ser, heparină și plasma citrat este mult mai mică decât concentrația determinată în EDTA-plasmă.

Stabilitatea invitro BNP difera pentru diferite metode (în funcție de epitopi de anticorpi). Plasma a fost conceput pentru a măsura concentrația de BNP, să fie depozitate la 0-4 ° C și efectuează măsurarea concentrației rapid. In general, BNP este stabil timp de 4 ore de depozitare la temperatura camerei și 8 ore la 4 ° C în probele de sânge integral conținând EDTA.

ser, heparină și EDTA-plasmă poate fi utilizată pentru a măsura concentrația de NT-proBNP. NT-proBNP în ser este stabil timp de 72 de ore de incubare la temperatura camerei.

BNP și NT-proBNP ca markeri biochimici de insuficienta cardiaca

Complexitatea diagnosticului insuficienta cardiaca este simptome nespecifice (dispnee, oboseală, edeme), care pot fi cauzate de alte boli, sau rezulta din obezitate sau o stare fizică precară a pacienților. Numeroase studii au confirmat eficacitatea utilizării BNP și NT-proBNP la pacienții cu insuficiență cardiacă acută și cronică. Cu toate acestea, trebuie să se înțeleagă că, pentru ambele markeri caracteristici de sensibilitate ridicată, dar are o specificitate scăzută în raport cu determinarea insuficienței cardiace. specificitate redusă datorită faptului că nivelurile ambelor markeri pot fi crescută în alte boli. Prin urmare, măsurarea concentrației de BNP (NT-proBNP) trebuie utilizat ca un test de diagnostic primar. În cazul în care concentrația de BNP (NT-proBNP) în sânge sub un nivel de prag, insuficiența cardiacă poate fi eliminată cu o probabilitate mare

98%. În acest caz, în cazul în care concentrația de BNP (NT-proBNP) este crescută, efectuarea ecocardiografiei este necesară pentru a confirma prezența disfuncției ventriculare stângi. Astfel, măsurarea concentrației de BNP (NT-proBNP) poate reduce grupul de pacienti care necesita exploatație ecocardiografie. În cazul insuficienței cardiace acute, măsurarea concentrației de BNP (NT-proBNP) facilitează stabilirea diagnosticului corect și începerea tratamentului. Astfel, BNP (NT-proBNP) nu sunt utilizate pentru diagnosticul de insuficienta cardiaca, si de a le exclude la pacienții cu simptome severe. În prezent, măsurarea concentrației de BNP (NT-proBNP), în plus față de examenul clinic, ecocardiografie, electrocardiograma si radiografie toracica este recomandata de Societatea Europeana de Cardiologie pentru diagnosticul de insuficienta cardiaca si disfunctie ventriculara stanga.