Alergeni pentru diagnosticul tuberculozei și a metodei de producție

Utilizare: imunologie veterinară, produs biologic, un diagnostic alergic al tuberculozei. EXPUNEREA INVENȚIEI alergen pentru diagnosticul tuberculozei este endoprotein izolat din tulpina filtru de cultură Mycobacterium boris N8, mol. m. 15 100 kDa, având un test de activitate in alergic 50000 10000 UI / ml. în fabricarea de „tuberculin UV“ numărul de etape de fabricație este redus de 2 ori mai mare comparativ cu metoda utilizată de obținere a unui preparat prin precipitarea proteinelor și ciclul tehnologic degidratantami este închis și curată, fără substanțe agresive de poluare. Preparatul este preparat prin ultrafiltrare. În acest scop, cultura filtratului Mycobacterium tuberculosis, crescute pe mediu sintetic și inactivat prin încălzire, a trecut printr-o membrană de filtrare cu o capacitate de reținere de 100 kD, atunci permeatul rezultată este concentrată pe membrane cu o capacitate de reținere de 15 kDa și normalizează conținutul UI, sodiu și fenol clorură în 1 ml. 2. n. f ly 2 il.

Prezenta invenție se referă la imunologie, în special pentru producția de Biologicals pentru diagnosticul alergic al tuberculozei.

Cunoscută folosit în acest scop în lume purificată PPD (Purificat Protein Derivative) cu tuberculină, care este o proteină derivată chimic din cultura filtratului Mycobacterium tuberculosis, crescute pe mediu sintetic [1, 2, 3] Proteinele din filtratul de cultură se precipită cu acid tricloracetic, sulfat de amoniu, urmată de purificare prin reactivi specificați reprecipitarii repetate sau alcool. O astfel de metodă de fabricare de tuberculină utilizat în toate țările care produc droguri. Astfel, în tehnologia de producție internă cu tuberculină pentru proteina în scopuri veterinare din Mycobacterium tuberculosis filtratului de cultură a fost precipitat cu acid tricloracetic, reprecipitat cu sulfat de amoniu și eliberat de sulfati prin dializă cu apă de la robinet (schema 1, fig. 1).

In practica medicala, proteina se precipită cu acid tricloracetic, apoi purificat și deshidratat cu alcool și acetonă.

Tuberculina este un amestec de diferite fracțiuni cu greutate moleculară de peptide cu greutate moleculară mică la compuși de proteine ​​cu greutate moleculară mare. Cuprins în fracțiuni de tuberculină proteice macromoleculare au antigenicitate pentru a induce formarea de anticorpi la animale, și hipersensibilitate imediată [4] reduce specificitatea speciilor preparatului, ceea ce complică diagnosticul tuberculozei și necesită folosirea unor metode de cercetare suplimentare la stabilirea animalului pentru starea de boală.

Procesul de fabricație cu tuberculină deschis și în mai multe etape, când procesarea proteinelor se întâmplă contaminarea microfloră sale, ceea ce duce la formarea în prepararea enzimelor proteolitice care reduc activitatea tuberculin în timpul depozitării [5] și alte proteine ​​străine care afectează negativ specificitatea medicamentului.

În diferite etape ale procesului sunt pierderi mari de proteine. Aceste sume pierderi (în raport cu conținutul inițial de proteine ​​din filtratul de cultură), în precipitarea cu acid tricloracetic și 42% sulfat de amoniu până la 30% prin dializă la 4% randament final de proteină a fost de 20% la original [6] Utilizarea în fabricarea de produse chimice agresive de droguri și apoi evacuate în sistemul de canalizare poluează mediul înconjurător.

Este cunoscută utilizarea în fabricarea unei metode cu tuberculină purificată prin ultrafiltrare kolloksilinovye sau altă membrană pentru a concentra compușii organici din filtratul de cultură și se îndepărtează constituenții non-coloidal și de schimb și autoliza mycobacterii produse moleculare mici. Tuberkuloprotein unui astfel de concentrat este apoi degidratantami precipitat (acid tricloracetic, sulfat de amoniu) [1, 2, 7] că aceasta nu reduce cantitatea de proteine ​​cu greutate moleculară mare.

De asemenea, se cunoaște utilizarea în laborator folosind metoda membrane de ultrafiltrare cu o capacitate de retenție diferită pentru izolarea agentului cauzator de cultură a tuberculozei fracțiuni proteice filtratului cu greutăți moleculare diferite, în scopul de a studia proprietățile lor [12, 13] (prototip). Metoda constă în cultivarea agentul cauzal al speciei umane tuberculoza, tulpina H37 Rv, compartiment sintetic nutritiv mediu de cultură filtrat și distribuindu-l pe membranele de filtrare cu o capacitate de reținere de 10 kDa și 1 kDa. Deoarece o parte dintr-un concentrat care conține un compus cu greutate moleculară 10 kDa și mai mare, proteina cu tuberculină produsă prin precipitare cu sulfat de amoniu, urmată de desalinizarea soluției, o filtrare de sterilizare și liofilizare.

Cu toate acestea, în ciuda rezultatelor pozitive ale unora dintre aceste studii, o metodă pentru fabricarea unei tuberculin ultrafiltrare încă nu a găsit aplicare practică datorită randamentului scăzut al produsului cu o greutate moleculară îngustă a proteinei conținută în ea și tehnologie, prin urmare, neeconomic.

Mai mult decât atât, la tuberculină, fabricate din M. tuberculosis, conține antigene micobacteriene mai generice în comparație cu medicamentul, care este utilizat pentru a produce M. bovis, care reprezinta specificitatea sa specie scăzută și animalele infectate cu M. bovis, reacționează într-o măsură mai mare pe omolog alergen [8, 9, 10] prin urmare, pentru uz veterinar în diagnosticul tuberculozei la animale este mai indicat să se crească eficiența formulării utilizate de cercetare preparate din M. bovis.

Scopul invenției este de a furniza o tuberculină constând din porțiunea cea mai activă și specifică a spectrului proteic de Mycobacterium tuberculosis, cu proces continuu și economic, fără utilizarea de reactivi chimici.

Acest lucru se realizează prin creștere pe un mediu sintetic M. bovis, tulpina N 8 [11] timp de 6-8 săptămâni, inactivarea culturii prin autoclavare, compartiment cultură filtrat din masa bacteriană care trece prin pânza de placă de filtrare și se filtrează. Apoi, filtratul de cultură rezultat a fost trecut succesiv prin membrana (lamelar, laminate sau ca fibre goale), cu o retenție de 100 și 15 kDa.

După ultrafiltrarea prin membrane de 100 kDa concentrat aruncate. Filtratul a fost supus ultrafiltrării prin membrane de 15 kDa, filtratul îndepărtat și concentrat care conține un compus cu greutate moleculară 15-100 kDa, este utilizat ca produs dorit (Schema 2 procesul procesului de fabricație „tuberculinei UV“, fig. 2).

A circuite de comparație 1 și 2 (fig. 1 și 2), în fabricarea de „tuberculin UV“ numărul de etape de fabricație este redus la 2 ori.

EXEMPLE EXEMPLUL 1 Pentru producerea de „tuberculin UV“ 100 de litri de cultură filtrat M. bovis, tulpina N 8, cultivate timp de 8 săptămâni, în mediu sintetic și inactivat prin încălzire, trecut printr-o membrane de filtrare mod de concentrare cu o capacitate de reținere 100 kDa. Gradul de concentrare este egal cu 50. Astfel, au fost obținute 2 litri de concentrat și 98 L de permeat.

Concentratul care conține compusul cu greutate moleculară mai mult de 10 kDa, a fost eliminată, iar permeatul cu compuși de mai puțin de 100 kDa a fost filtrată printr-o membrană cu o capacitate de reținere de 15 kDa în modul de concentrare. Gradul de concentrare a soluției care conține compusul cu o greutate moleculară de la 15 până la 100 kD, egal cu 10. Astfel de 9,8 l de concentrat a fost preparat și 88,2 litri de permeat care conțin substanțe cu greutate moleculară joasă.

Permeatul de a fost îndepărtat și concentratul se diluează cu soluție de clorură de sodiu ce conține fenol și glicerol, pentru a produce o proteină de 1 ml soluție de tuberculinare 1 mg, clorură de sodiu 0,85%, 10% glicerină și 0,3% fenol.

Formularea a fost supus la filtrare sterilizantă și ambalate aseptic în flacoane de capacitate 10 și 20 ml.

Probele au fost testate pentru activitatea în comparație cu seria de referință PPD tuberculinei la mamifere, în conformitate cu GOST 16739-88 „cu tuberculină purificată (PPD) pentru mamifere“ și specificitatea speciilor în conformitate cu TU 10-19-518-87 „Alergen complex purificat uscat micobacterii atipice (KAM)“.

EXEMPLU Exemplul 4. Test de specificitate a speciei „tuberculinele UV“ conținând proteină fractii mol. m. mai mult de 100 și mai mică de 100 kDa, la cobaii sensibilizați cu un amestec de culturi skotohromogennyh (M. scrofulaceum) și nefotohromogennyh (M. intracellulare) micobacterii atipice. In acest set mai pronunțat specii de specificitate „tuberculin UV“ conținând greutate moleculară fracție de proteină: cel puțin 100 kDa, numărul de răspuns la acest medicament animalelor a fost de 1,5 ori mai puțin, iar reacția la animalele răspund de 1,2 ori mai puțin intense.

Rezultatele experimentelor 3 și 4 arată că activitatea proteinei Mycobacterium tuberculosis nu depinde de greutatea lor moleculară și specii de specificitate crește tuberkuloproteina cu scăderea greutății moleculare a proteinei. Astfel, îndepărtarea proteinelor cu greutate moleculară de tuberculină peste 100 kDa crește specificitatea ei specii.

(56) 1. Seibert F.B. Izolarea și proprietățile derivatului psotein purificat de tuberculină Am. Rev. Tuberc. 1934, v. 30, N 6, p. 713-720.

2. Linnikova MA Derivatul proteic purificat de tuberculină ,. Problema tuberculozei, M. 1939, N 12.

3. Tsumina T. Kuvabara C. Metoda de producere a tuberculină. Brevetul japonez N 582745, 09.19.73.

4. Petrov RV Imunologie. M. Medicine, 1983, p. 368.

6. Shevyrev NS Îmbunătățirea tehnologiei de tuberculină industriale uscate purificată la mamifere. Tr. Preparate VGNKI veterinar, M. 1972 t. XVIII.

7. Collins F. Mielul J.R. Joung D.B. Infect și Immun. 1988, v. 56, N 5, p. 1260-1266.

8. Lesslie I.W. Hebert C.N. BIRN K.T. Compararea specificității tuberculinei umane și PPD bovin pentru testarea bovinelor. 1. Republica Irlanda Vet. Rec. 1975, v. 96, N 15, p. 332-334.

9. Chaparas S.D. Compoziția de antigeni ai diferitelor specii micobacteriene detectate cu un ser de referință M. tuberculosis. Amer. Rev. Resp. Dis. 1975, v. 112, N 1, p. 135-137.

10. Baizden L.A. Comparația proteinelor și caracteristicile specifice ale tuberculozei umane și bovine Amer. J. Vet. Res, 1952, v. 13, N 48, p. 338-344.

11. Instrucțiuni pentru producerea și controlul tuberculinei purificat (PPD) pentru mlekopit. aprobat. BS 30/12/85.

12. Affronti L.F Ouchterlony O. Lind A. et. Al. Tuberculoza, 1983 N 2, p. 66-68.

13. Affronti L.F Ouchterlony O. Lind A. Ridell M. Wisingerova E.A OMS efort pentru a izola testele cutanate la tuberculină specii specifice de cooperare. Int simpozion vaccinuri BCG si tuberculinele, parte M. Budapesta, 1986, p. 503-509.

1. Un alergen pentru diagnosticarea tuberculozei, caracterizat prin aceea că tulpina izolată din Mycobacterium boris N 8 endoprotein izolat din filtrat de cultură din următoarea compoziție biochimică, Protein 70 80 Lipid 05 august 04 august polizaharidic, acid nucleic: ADN 0,5 1,5
ARN 0,10 0,15
greutate moleculară de 15 100 kD datorită utilizării membranelor cu o capacitate de reținere de 15 și 100 kDa;
activitate alergică testare 50000 10000 UI / ml.

2. Procedeu de obținere a unui alergen pentru diagnosticul tuberculozei, care cuprinde cultura de creștere a tulpinii micobacteriilor într-un mediu nutritiv sintetic, inactivare autoclavizare, cultură compartiment filtrat, concentrația acestuia prin ultrafiltrare, separarea filtratului, urmată de concentrare repetată prin ultrafiltrare și izolarea produsului dorit sub formă de concentrat, caracterizat prin aceea că cultivati tulpina Mycobacterium boris N 8, concentrarea prin ultrafiltrare se realizează pe o membrană cu un prag de separare de 10 100 kDa repetate concentrarea filtratului obținut cu o membrană este realizată pe pragul de separare 15 1,5 kDa, produsul așteptat este izolat cu mol. m. 15 100 kD.